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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 为什么做PCR时候模板浓度高了会扩增不出目的片段？
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wuyuan1992

金虫 (正式写手)

[求助] 为什么做PCR时候模板浓度高了会扩增不出目的片段？

在做真菌ITS序列扩增鉴定种属的时候，师兄让我将总DNA梯度稀释，分别取原液、稀释十倍、稀释一百倍的总DNA作为模板进行PCR扩增。因为凭师兄的经验而谈，有时候可能总DNA浓度太高会导致扩增不出，一次性梯度稀释扩增出目的产物的可能性会很高。
     我想问的问题是：
     1、为什么总DNA浓度高作为模板会导致扩增不出东西？
     2、PCR时对于模板的浓度有什么规定么？
   希望各位虫友能够帮忙解答，在此谢过～
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非淡泊无以明志，非宁静无以致远。
1楼2012-07-24 20:41:54
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cynthia8225

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖@！ 2012-07-25 20:33:56
这个问题我是这么理解的DNA浓度太高了会导致非特异性扩增的上升，然后就是当你的DNA浓度高的时候，由于你的是总DNA，所以蛋白含量也会上升影响PCR反应体系，再就是DNA是具有高级结构的，浓度过高对你的引物结合并不是很好！
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2楼2012-07-25 14:41:29
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wuyuan1992: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 非常感谢！我感觉很有道理～ 2012-07-26 07:45:19
同意楼上提的几条

我考虑还有其他原因，如下
1 模板浓度过高，在退火时模板会和引物竞争，模板与模板互相结合
2 在前几轮PCR反应中，引物只是不断反复和模板结合，和产物结合较少
3 模板浓度过高，最终电泳时会有条带弥散

至于最佳浓度，参考分子克隆实验指南的说法，用哺乳动物基因组DNA做模板时，每个PCR反应所加入DNA约为1 微克，而酵母，细菌与质粒DNA作为模板时，典型模板量应为10 ng，1 ng和1 pg
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
3楼2012-07-26 00:06:10
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普通回帖

215421160

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
另外就是，看你的DNA是从什么地方提取的了，从某些样品例如粪便中提取，会有很多Inhibitor,因而稀释一下就会扩出来。楼上几位讲得很好，我只是补充一下。
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4楼2012-07-26 02:40:24
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wuyuan1992

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cynthia8225 at 2012-07-25 14:41:29
这个问题我是这么理解的DNA浓度太高了会导致非特异性扩增的上升，然后就是当你的DNA浓度高的时候，由于你的是总DNA，所以蛋白含量也会上升影响PCR反应体系，再就是DNA是具有高级结构的，浓度过高对你的引物结合并不 ...

非常感谢～
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5楼2012-07-26 07:45:50
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wuyuan1992

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 215421160 at 2012-07-26 02:40:24
另外就是，看你的DNA是从什么地方提取的了，从某些样品例如粪便中提取，会有很多Inhibitor,因而稀释一下就会扩出来。楼上几位讲得很好，我只是补充一下。

嘿嘿，我的DNA是提取的真菌的总DNA,是液体纯培养发酵的菌丝～非常感谢你的补充～
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6楼2012-07-26 07:46:53
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匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
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7楼2012-07-26 08:12:01
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by starseacow at 2012-07-26 00:06:10
同意楼上提的几条

我考虑还有其他原因，如下
1 模板浓度过高，在退火时模板会和引物竞争，模板与模板互相结合
2 在前几轮PCR反应中，引物只是不断反复和模板结合，和产物结合较少
3 模板浓度过高，最终电泳时 ...

学习了!
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Bethechangeyouwishtosee.
8楼2012-07-26 08:17:10
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小灰灰128

金虫 (正式写手)
仔细看一下DNA聚合酶的说明书，上面有详细的PCR反应体系，反应中各个成分的用量都有说明的。祝好！
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9楼2012-07-26 08:23:24
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newmeer

新虫 (初入文坛)
正在为这个事情发愁，感谢！
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10楼2013-03-01 16:52:10
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