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xiangquanju金虫 (小有名气)
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[求助]
求助各位用red系统敲除大肠杆菌基因的虫友们~~~
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我用red系统敲除大肠杆菌的基因，一直不成功。在大肠杆菌中敲除基因的技术已经很成熟了，可是我仍旧是个新手，身边也没人做过，下面是我做的步骤： 希望各位虫友提点宝贵的意见，都做了好久了， 1 PCR从pkd4上扩增目的片段。胶回收后用dpnI处理2h后胶回收。DNA溶解在ddH2O。 2 接种BW25113 (已经转了pKD46) 于 10ml LB(100ug/ml Amp) 培养基中， 30 度过夜培养。转种 1ml 过夜培养菌液于100ml LB (100ug/ml Amp) 30 度 培养1h加入阿拉伯糖至终浓度为5mM. 当OD ~0.5-0.6, 将细胞放置在冰水浴上10min，离心收集细胞, 用 ddH2O 洗四次. 细胞溶解在 1ml ddH2O （所以的管子和溶液都是遇冷了的，离心也是低温离心） 3 100ng+50ul 细胞加入1mm Bio-Rad cuvette.电击参数是1800v, 25uF, 200Ω, 电击时间为4.9ms.电击后迅速加入预热了的LB 培养基 (含有5mM)。低转速 ，37度恢复培养2-3h然后涂板 4 因为我想敲掉的是一个膜蛋白基因，所以将卡那霉素浓度设为5ug/ml, 15ug/ml and 25ug/ml.所有浓度的平板上都有克隆。 但是问题是当我用基因特异性因为进行验证的时候，扩增出来的都是我的目的基因，而不是抗生素片段。实在想不明白哪里出问题了，基因没敲除成功，那么为什么还在平板上长了呢，既然长了，就说明有卡那霉素基因表达了，所以怀疑dpnI没处理干净，但是也不至于啊，50ul体系里我加了3ul酶，并且PCR的模板也是1/50的质粒加了1ul  |
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“但是问题是当我用基因特异性因为进行验证的时候，扩增出来的都是我的目的基因，而不是抗生素片段。实在想不明白哪里出问题了，基因没敲除成功，那么为什么还在平板上长了呢，既然长了，就说明有卡那霉素基因表达了，所以怀疑dpnI没处理干净，但是也不至于啊，50ul体系里我加了3ul酶，并且PCR的模板也是1/50的质粒加了1ul” 基因敲除，我好久没有做了，去查查资料。这种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究.Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5'端向3'端降解DNA,产生3'突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性.Red同源重组技术具有同源序列短(40～60 bp)、重组效率高的特点.这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶.此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。 如果，大肠杆菌基因重组成功，有可能是外源基因进入了大肠杆菌基因组，但是未必一定破坏了需要敲出的的目的基因，应该加强同源序列以增加同源重组的专一性。 |
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