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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助各位用red系统敲除大肠杆菌基因的虫友们~~~
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

[求助] 求助各位用red系统敲除大肠杆菌基因的虫友们~~~

我用red系统敲除大肠杆菌的基因，一直不成功。在大肠杆菌中敲除基因的技术已经很成熟了，可是我仍旧是个新手，身边也没人做过，下面是我做的步骤：
希望各位虫友提点宝贵的意见，都做了好久了，
1 PCR从pkd4上扩增目的片段。胶回收后用dpnI处理2h后胶回收。DNA溶解在ddH2O。
2 接种BW25113 (已经转了pKD46) 于 10ml LB(100ug/ml Amp) 培养基中， 30 度过夜培养。转种 1ml 过夜培养菌液于100ml LB (100ug/ml Amp) 30 度 培养1h加入阿拉伯糖至终浓度为5mM. 当OD ~0.5-0.6,  将细胞放置在冰水浴上10min，离心收集细胞, 用 ddH2O 洗四次. 细胞溶解在 1ml ddH2O （所以的管子和溶液都是遇冷了的，离心也是低温离心）
3 100ng+50ul 细胞加入1mm Bio-Rad cuvette.电击参数是1800v, 25uF, 200Ω, 电击时间为4.9ms.电击后迅速加入预热了的LB 培养基 (含有5mM)。低转速 ，37度恢复培养2-3h然后涂板
4 因为我想敲掉的是一个膜蛋白基因，所以将卡那霉素浓度设为5ug/ml, 15ug/ml and 25ug/ml.所有浓度的平板上都有克隆。

但是问题是当我用基因特异性因为进行验证的时候，扩增出来的都是我的目的基因，而不是抗生素片段。实在想不明白哪里出问题了，基因没敲除成功，那么为什么还在平板上长了呢，既然长了，就说明有卡那霉素基因表达了，所以怀疑dpnI没处理干净，但是也不至于啊，50ul体系里我加了3ul酶，并且PCR的模板也是1/50的质粒加了1ul
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1楼 2012-05-16 00:52:44
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果断悉尼

铁杆木虫 (知名作家)

三沙市名誉常务副市长

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这么辛苦发帖 我只能祝福下你把
敲除我不会 哈哈
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我的微信号happyjk5208，谢绝闲聊
2楼2012-05-16 01:45:46
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 果断悉尼 at 2012-05-16 01:45:46:
这么辛苦发帖 我只能祝福下你把
敲除我不会 哈哈

谢谢版主，确实很辛苦啊，敲了那么久，也没敲掉
关键是别人的paper里面都敲掉了的
不过我也发邮件去问paper的作者了，希望能回复
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3楼2012-05-16 01:53:03
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-18 15:30:00
“但是问题是当我用基因特异性因为进行验证的时候，扩增出来的都是我的目的基因，而不是抗生素片段。实在想不明白哪里出问题了，基因没敲除成功，那么为什么还在平板上长了呢，既然长了，就说明有卡那霉素基因表达了，所以怀疑dpnI没处理干净，但是也不至于啊，50ul体系里我加了3ul酶，并且PCR的模板也是1/50的质粒加了1ul”
基因敲除，我好久没有做了，去查查资料。这种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究.Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5'端向3'端降解DNA,产生3'突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性.Red同源重组技术具有同源序列短(40～60 bp)、重组效率高的特点.这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶.此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。
如果，大肠杆菌基因重组成功，有可能是外源基因进入了大肠杆菌基因组，但是未必一定破坏了需要敲出的的目的基因，应该加强同源序列以增加同源重组的专一性。
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4楼2012-05-18 10:49:09
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lockye

铜虫 (正式写手)
加油，多敲几次
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5楼2012-05-18 11:22:33
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syn1985

木虫 (正式写手)
LZ找到原因没啊？分享一下
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6楼2012-05-18 16:18:15
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by syn1985 at 2012-05-18 16:18:15:
LZ找到原因没啊？分享一下

目前来看，我要敲除的基因是一个致死基因，敲掉了，细胞就不长了
不知道有没有同学做过致死基因的敲除，应该怎么做，我也还在看文献，暂时还没理出思路呢
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7楼2012-05-19 04:36:14
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-05-19 04:36:14:
目前来看，我要敲除的基因是一个致死基因，敲掉了，细胞就不长了
不知道有没有同学做过致死基因的敲除，应该怎么做，我也还在看文献，暂时还没理出思路呢

楼主是咋样确定敲的是致死基因的啊
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8楼2012-05-19 09:08:20
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fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-05-19 04:36:14:
目前来看，我要敲除的基因是一个致死基因，敲掉了，细胞就不长了
不知道有没有同学做过致死基因的敲除，应该怎么做，我也还在看文献，暂时还没理出思路呢

先引入质粒替补表达该基因，然后在基因组上敲除
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9楼2012-05-19 09:42:27
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shunfeng12

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-05-16 01:53:03
谢谢版主，确实很辛苦啊，敲了那么久，也没敲掉
关键是别人的paper里面都敲掉了的
不过我也发邮件去问paper的作者了，希望能回复...

敲除的是大肠杆菌膜蛋白的哪个基因？
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10楼2012-06-14 11:27:36
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