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xiangquanju

金虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
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虫号: 999190
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专业: 生物化学

[求助] 求助各位用red系统敲除大肠杆菌基因的虫友们~~~

我用red系统敲除大肠杆菌的基因，一直不成功。在大肠杆菌中敲除基因的技术已经很成熟了，可是我仍旧是个新手，身边也没人做过，下面是我做的步骤：
希望各位虫友提点宝贵的意见，都做了好久了，
1 PCR从pkd4上扩增目的片段。胶回收后用dpnI处理2h后胶回收。DNA溶解在ddH2O。
2 接种BW25113 (已经转了pKD46) 于 10ml LB(100ug/ml Amp) 培养基中， 30 度过夜培养。转种 1ml 过夜培养菌液于100ml LB (100ug/ml Amp) 30 度培养1h加入阿拉伯糖至终浓度为5mM. 当OD ~0.5-0.6, 将细胞放置在冰水浴上10min，离心收集细胞, 用 ddH2O 洗四次. 细胞溶解在 1ml ddH2O （所以的管子和溶液都是遇冷了的，离心也是低温离心）
3 100ng+50ul 细胞加入1mm Bio-Rad cuvette.电击参数是1800v, 25uF, 200Ω, 电击时间为4.9ms.电击后迅速加入预热了的LB 培养基 (含有5mM)。低转速，37度恢复培养2-3h然后涂板
4 因为我想敲掉的是一个膜蛋白基因，所以将卡那霉素浓度设为5ug/ml, 15ug/ml and 25ug/ml.所有浓度的平板上都有克隆。

但是问题是当我用基因特异性因为进行验证的时候，扩增出来的都是我的目的基因，而不是抗生素片段。实在想不明白哪里出问题了，基因没敲除成功，那么为什么还在平板上长了呢，既然长了，就说明有卡那霉素基因表达了，所以怀疑dpnI没处理干净，但是也不至于啊，50ul体系里我加了3ul酶，并且PCR的模板也是1/50的质粒加了1ul