24小时热门版块排行榜

>论坛更新日志 (3064)
>虫友互识 (235)
>导师招生 (197)
>文献求助 (188)
>论文投稿 (69)
>硕博家园 (56)
>休闲灌水 (55)
>公派出国 (49)
>考博 (42)
>招聘信息布告栏 (37)
>论文道贺祈福 (32)
>催化 (29)
>教师之家 (27)
>找工作 (27)
>考研 (25)
>博后之家 (23)

返回列表

小鸟剑客

金虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 2 (幼儿园)
金币: 1519.9
散金: 16
红花: 1
帖子: 224
在线: 50.8小时
虫号: 1257858
注册: 2011-04-07
性别: GG
专业: 神经生物学

[求助] PCR扩启动子序列的问题

我要扩3200bp的启动子片段，结果用了TAKARA公司的rtaq和PrimeSTARMax聚合酶和TRANSGENE的HiFi酶都跑出来整片的弥散带且没有主带（从100-15000都是弥散的）用TAKARA的LA taq则跑出来另外的片段，求高手相助。
经历：这个片段的引物我去年跑了半年了没问题，以前都可以跑出来回收的，今年来的时候第一次做也没问题，到第二次做的时候就跑出弥散带了，以后1个半月都跑不出主带来。1.我以为是引物的问题，用了新引物，跟以前的一对引物一起跑，结果还是没主带。2.可能是水的问题，换水也没结果。3.重提了3次DNA，前两次用TRANSGENE的DNA提取试剂盒，如图1中所示。后一次是用CTAB法提的。结果两次的提的DNA只有LA taq酶跑出那个奇怪的带4.DNTP和buffer都是配套使用的，也没有什么问题5.给引物和模板给4个人，分别作都是弥散带。6.反应体系15ul.25ul.20ul.50ul都跑过，结果都不好。PCR程序以rTaq为例：
1.94℃  5m
2.94℃  50s
3.60℃  50s(华大建议的正反引物温度为64℃和66.7℃)
4.72℃  3m30s  2 35
5.72℃  10m
6.4℃    1h
LA taq酶跑出的怪带的程序是
1.94℃    5m
2.94℃    1m
3.72℃    2m (温度是每个循环降0.5℃)
4.72℃    4m 2    15
5.94℃    1m
6.65℃    2m
7.72 ℃    3m30s    5    25
8.72 ℃    10m
9.4 ℃       1h
求高手帮忙解决下啊，快疯了

回复此楼