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小鸟剑客金虫 (小有名气)
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[求助]
PCR扩启动子序列的问题
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我要扩3200bp的启动子片段，结果用了TAKARA公司的rtaq和PrimeSTARMax聚合酶和TRANSGENE的HiFi酶都跑出来整片的弥散带且没有主带（从100-15000都是弥散的）用TAKARA的LA taq则跑出来另外的片段，求高手相助。 经历：这个片段的引物我去年跑了半年了没问题，以前都可以跑出来回收的，今年来的时候第一次做也没问题，到第二次做的时候就跑出弥散带了，以后1个半月都跑不出主带来。1.我以为是引物的问题，用了新引物，跟以前的一对引物一起跑，结果还是没主带。2.可能是水的问题，换水也没结果。3.重提了3次DNA，前两次用TRANSGENE的DNA提取试剂盒，如图1中所示。后一次是用CTAB法提的。结果两次的提的DNA只有LA taq酶跑出那个奇怪的带4.DNTP和buffer都是配套使用的，也没有什么问题5.给引物和模板给4个人，分别作都是弥散带。6.反应体系15ul.25ul.20ul.50ul都跑过，结果都不好。PCR程序以rTaq为例： 1.94℃ 5m 2.94℃ 50s 3.60℃ 50s(华大建议的正反引物温度为64℃和66.7℃) 4.72℃ 3m30s 2 35 5.72℃ 10m 6.4℃ 1h LA taq酶跑出的怪带的程序是 1.94℃ 5m 2.94℃ 1m 3.72℃ 2m (温度是每个循环降0.5℃) 4.72℃ 4m 2 15 5.94℃ 1m 6.65℃ 2m 7.72 ℃ 3m30s 5 25 8.72 ℃ 10m 9.4 ℃ 1h 求高手帮忙解决下啊，快疯了 |
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2012-03-14 13:32:53, 83 K
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