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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接产物双酶切
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西交-flx

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接产物双酶切

请教各位大侠：
      近期做基因和真核表达载体连接实验已有个把个月，由于真核表达载体用的是pEGFP-N1，大小有4.7bp，插入的载体有2.4bp，分子量过大，导致很难连接上，重复做了四五周期连接实验；最近一次的连接产物跑胶出来三条带，貌似连接上了，之后把连接产物双酶切，跑胶显示两条带，且分子量一个为载体分子量，另一个为插入片段分子量，初步验证连接上，故送菌液去测序，但是测序结果出来只有载体的信息无任何插入基因的信息，显示好像没连接上，近期实验做的焦头烂额的，想请教大家原因，小女不胜感激～～～
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  • 附件 1 : 双酶切跑胶.bmp
    • 2012-07-17 10:58:35, 433.05 K

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1楼 2012-07-17 10:59:04
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-18 13:49:11
pEGFP-N1，大小有4.7kp，插入的载体有2.4kp,说实在的片段一点也不大，这个载体我经常用，比较好连接的，从你电泳的图很容易看出问题：
    载体建议你加到150ng，你的图上直接看出载体加的太多了，不知道你板长的怎么样，片段随便你怎么加，必定片段比较大，一般DL2000的MK最上面的2KB条带是50ng每ul，所以你的载体估计都加到500ng以上了，还有连接后不用跑胶检查，直接转化就可以，严谨点的做个载体空白对照。然后做菌落PCR简单，再送测序。一般连接产物跑胶是显现湖装的，就想往上的拖尾PCR一样。
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西交-flx
4楼2012-07-17 15:31:59
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普通回帖

西交-flx

新虫 (初入文坛)
附件的最右边是DL2000的marker,从左到右依次是1到10 号，送了1，5，9号三管去测序的，结果都一样没连接上。
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2楼2012-07-17 11:26:45
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+5, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-17 21:01:06
amisking: 回帖置顶 2012-07-17 21:01:08
你的maker是DL2000的marker吗?最好用1kb的ladder跑,这样看不清楚.
先确定你的载体上没有你引物上的酶切位点,如果载体上有你引物上的位点,那么你双酶切检验的时候,很难分清楚是不是你要的目的片段.这个确定之后,连接转化之后,先菌液pcr,然后双酶切,最好送质粒过去测序,多送几个.
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coasttocoast。
3楼2012-07-17 11:33:41
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西交-flx

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-17 15:31:59
pEGFP-N1，大小有4.7kp，插入的载体有2.4kp,说实在的片段一点也不大，这个载体我经常用，比较好连接的，从你电泳的图很容易看出问题：
    载体建议你加到150ng，你的图上直接看出载体加的太多了，不知道你板长的怎 ...

DL2000的marker我上了 5 ul，按理来说，5 ul的量2KB处条带应该是50 ng。我当时把插入基因和载体分别双酶切回收后，分别上了5 ul 跑了胶，插入基因条带亮度远远高于载体的亮度，把他们连接体系的比例调到1：5左右才进行的连接实验，连接完做了菌液pcr，提取质粒后做了双酶切，都是阳性结果的，一般来说双酶切是比较准确的，很少出现假阳性，但是我的结果，连接质粒双酶切切出了正确条带，为什么测序结果显示没连接上呢？？？
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5楼2012-07-17 16:37:31
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西交-flx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-17 11:33:41
你的maker是DL2000的marker吗?最好用1kb的ladder跑,这样看不清楚.
先确定你的载体上没有你引物上的酶切位点,如果载体上有你引物上的位点,那么你双酶切检验的时候,很难分清楚是不是你要的目的片段.这个确定之后,连接 ...

菌液pcr 和 双酶切都是阳性结果的，按理来说  双酶切还比较准确，很少出现假阳性的，但是我的测序结果显示没有连接上，为什么会出现两个条带呢？
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6楼2012-07-17 16:40:32
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

先确定你的载体上没有你引物上的酶切位点,如果有的话，可能是载体的部分片段被切下来了。没有的话，在换个公司测序。
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coasttocoast。
7楼2012-07-17 17:16:18
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西交-flx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-17 17:16:18
先确定你的载体上没有你引物上的酶切位点,如果有的话，可能是载体的部分片段被切下来了。没有的话，在换个公司测序。

载体上有引物的酶切位点，但是两个酶切位点之间只有几bp，非常非常短的片段，不应该出来几kp的片段，所以不是载体的部分片段被切下来的。现在另外送了一家测序公司去测了，期待好结果。
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8楼2012-07-17 20:53:54
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极解答问题 2012-07-18 13:49:29
你拿连接产物去双酶切，不管连上与否结果不都应该是两个条带，一个载体，一个目标片段吧。所以个人认为你的验证方式就不严谨，仅仅凭这一点就拿去送测序，结果五花八门很正常。前面的实验不设计好，后面出问题了分析都不知问题出在哪。
我直白的说，做实验不要总存有侥幸心理，每一步都要验证好。不要等到后面出问题了，又分析不出来问题在哪里，又重头开始。不过这些都是我个人的实验习惯。仅仅和你交流一下。
另外建议你做连接载体量一定要少再少。不要总觉得不够。我在实验中一般浓度300ng/uL的载体我就切3uL,酶切后回收32uL洗脱体积，连接时就用1uL。仅供参考。
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9楼2012-07-18 08:35:58
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西交-flx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-18 08:35:58
你拿连接产物去双酶切，不管连上与否结果不都应该是两个条带，一个载体，一个目标片段吧。所以个人认为你的验证方式就不严谨，仅仅凭这一点就拿去送测序，结果五花八门很正常。前面的实验不设计好，后面出问题了分析 ...

l连接产物做双酶切有两种结果呀，如果片段和载体连接上了就会酶切出各自分子量的条带，如果没有连接上，但是又长斑了，而且也提出了质粒，就说明载体自连了，酶切时不会出现两个条带，只会出现载体分子量的条带。
之前每步实验都是经过跑胶验证的，先把目的片段扩增出来，胶回收，再分别双酶切目地片段和载体，使带有相同的粘性末端，然后分别胶回收，验证浓度比在1：5---1：10 之间后进行10 ul 的连接实验，之后转化，挑斑，摇菌，提质粒，菌液pcr验证和双酶切验证，都是阳性结果，而且双酶切条带刚好是载体和片段分子量，故才送去测序。
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10楼2012-07-18 09:13:26
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