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连接产物双酶切
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请教各位大侠： 近期做基因和真核表达载体连接实验已有个把个月，由于真核表达载体用的是pEGFP-N1，大小有4.7bp，插入的载体有2.4bp，分子量过大，导致很难连接上，重复做了四五周期连接实验；最近一次的连接产物跑胶出来三条带，貌似连接上了，之后把连接产物双酶切，跑胶显示两条带，且分子量一个为载体分子量，另一个为插入片段分子量，初步验证连接上，故送菌液去测序，但是测序结果出来只有载体的信息无任何插入基因的信息，显示好像没连接上，近期实验做的焦头烂额的，想请教大家原因，小女不胜感激～～～ |
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2012-07-17 10:58:35, 433.05 K
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reallpf
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极解答问题 2012-07-18 13:49:29
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极解答问题 2012-07-18 13:49:29
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你拿连接产物去双酶切，不管连上与否结果不都应该是两个条带，一个载体，一个目标片段吧。所以个人认为你的验证方式就不严谨，仅仅凭这一点就拿去送测序，结果五花八门很正常。前面的实验不设计好，后面出问题了分析都不知问题出在哪。 我直白的说，做实验不要总存有侥幸心理，每一步都要验证好。不要等到后面出问题了，又分析不出来问题在哪里，又重头开始。不过这些都是我个人的实验习惯。仅仅和你交流一下。 另外建议你做连接载体量一定要少再少。不要总觉得不够。我在实验中一般浓度300ng/uL的载体我就切3uL,酶切后回收32uL洗脱体积，连接时就用1uL。仅供参考。 |
9楼2012-07-18 08:35:58
2楼2012-07-17 11:26:45
tupac225
金虫 (正式写手)
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3楼2012-07-17 11:33:41
tianyinghu
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-18 13:49:11
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-18 13:49:11
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pEGFP-N1，大小有4.7kp，插入的载体有2.4kp,说实在的片段一点也不大，这个载体我经常用，比较好连接的，从你电泳的图很容易看出问题： 载体建议你加到150ng，你的图上直接看出载体加的太多了，不知道你板长的怎么样，片段随便你怎么加，必定片段比较大，一般DL2000的MK最上面的2KB条带是50ng每ul，所以你的载体估计都加到500ng以上了，还有连接后不用跑胶检查，直接转化就可以，严谨点的做个载体空白对照。然后做菌落PCR简单，再送测序。一般连接产物跑胶是显现湖装的，就想往上的拖尾PCR一样。 |
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西交-flx4楼2012-07-17 15:31:59
