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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 简并引物克隆中的一些问题
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 简并引物克隆中的一些问题

我设计了一对兼并引物，想从未知基因组中克隆出一个酰胺酶基因片段。BLAST以后发现和大豆慢生根瘤菌的酰胺酶的序列有99%的相似性，而且我们实验室也在做这种大豆慢生根瘤菌的酰胺酶。起初怀疑是染菌了，又重新克隆了一次（很小心，避免染菌）可测序结果还是一样的。
所以我怀疑是我这种菌的基因组被污染了，请问基因组会这么容易被污染吗？而且自从我们实验室有了大豆慢生根瘤菌后，我这种菌的基因组再也没有用过，这是第一次用。请高人指点。
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nothing isimpossible
1楼 2012-07-12 12:13:38
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-15 18:19:35
未知基因组?酰胺酶基因片段?那你根据大豆的慢生根瘤菌全长基因设计引物PCR看下...或许你的未知基因组来自于慢生根瘤菌。

我这种菌是实验室筛出来的一种野生杆菌，只是这种菌的全基因组的基因序列还没有被报道。所以只能设计兼并引物进行克隆。
请教一下，如果两种不同的菌，他们编码的一种酶的基因序列会有99%的相似性吗？
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nothing isimpossible
6楼2012-07-25 10:06:13
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360591345

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-12 13:59:04
99%的同源性不是已经很高了吗，怎么还会怀疑污染呢？用普通聚合酶做PCR的时候是有可能P错的，除非是高保真的酶才可能达到100%。
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2楼2012-07-12 13:54:41
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 360591345 at 2012-07-12 13:54:41
99%的同源性不是已经很高了吗，怎么还会怀疑污染呢？用普通聚合酶做PCR的时候是有可能P错的，除非是高保真的酶才可能达到100%。

我的意思是：我做的是从另外一种菌种克隆酰胺酶。但我们实验室有其他同学从大豆慢生根瘤菌中克隆出了酰胺酶，现在我克隆出的酰胺酶和大都慢生根瘤菌中克隆出的酰胺酶相似性有99%。所以我怀疑我的基因组污染了大都慢生根瘤菌的基因组。
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nothing isimpossible
3楼2012-07-15 10:57:45
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moqiyilei

金虫 (小有名气)
应该是你提取RNA时的材料不干净，然后导致cDNA受到污染，同时兼并引物与菌的特异性最高，所以你就扩增得到了菌中的gene了。
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4楼2012-07-15 13:15:41
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