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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 以酵母基因组为模板进行PCR扩增没有条带
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夏日小黄瓜

金虫 (初入文坛)

[求助] 以酵母基因组为模板进行PCR扩增没有条带

实验室有三株构建好的毕赤酵母工程菌
都带有我需要的目的基因（大小约为2kb）
我用酵母基因组提取试剂盒分别提取了三者的基因组
用目的基因的上下游引物进行PCR扩增
使用的是Taq酶（想要先确保能够扩增出来再使用高保真酶）
预变性94℃×5min
变性94℃×30s
退火55℃×30s
延伸72℃×2min
补延伸72℃×10min
4℃∞
30个循环
其中只有一种酵母基因组扩增出了我要的条带
但是测序表明有很多点突变和碱基缺失
后来我改变退火温度51，53，55，57，59都试过
每次都带有P得出结果的那个基因组做对照
还是没条带
我想请教一下：
1.如何能从另两种酵母基因组扩增出条带？
2.就算扩增出条带，能够保证测序正确么？为什么穿梭质粒构建好了也测序正确的，重组到酵母基因组中之后再次扩增目的基因会有这么多的缺失和点突变呢？如果缺失和突变不能避免，那么用酵母基因组作为模板可靠吗？
多谢！！！
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1楼 2012-07-03 09:55:40
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夏日小黄瓜

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 满桌儿 at 2012-07-05 23:41:31
突变可能是你用的模板质粒浓度太大了，稀释1000，5000，10000倍看看，只要能出较亮的带就行，循环数30够了。

谢谢！我去试试看~
赞一下 回复此楼
6楼2012-07-06 08:45:50
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夏日小黄瓜

金虫 (初入文坛)
麻烦大家帮忙出点主意吧
一个头两个大了。。。
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2楼2012-07-04 16:05:24
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的目的片段与酵母基因组相似性多高？你扩增出来的片段很有可能不是你目的片段，而是酵母基因组自有的片段。
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3楼2012-07-04 17:01:01
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夏日小黄瓜

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by caoluoyuan at 2012-07-04 17:01:01
你的目的片段与酵母基因组相似性多高？你扩增出来的片段很有可能不是你目的片段，而是酵母基因组自有的片段。

因为三种酵母基因组中已经整合进的片段也就是我需要的片段是人源的
我的引物就是目的基因片段的上下游片段
扩增出来的那一个测序过 有缺失和突变 但是大部分还算是目的基因片段
只是想不通为什么另外两种酵母基因组P不出来。。。
谢谢！
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4楼2012-07-05 09:10:51
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