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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

[交流] 蛋白不纯，如图，大家帮忙分析一下

蛋白几个月之前还很纯，就一条主带和一点点的杂带。但慢慢的好像菌种退化了，表达的蛋白如图，上边有好多类似多聚的东西，但跑胶应该变性了才对啊。我用的是rosetta表达，蛋白不稳定很容易沉淀，但过了离子交换后加DTT沉淀情况明显减轻，大家帮忙分析一下啊，这东西真蛋疼。。。。。
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1楼2012-06-30 16:20:43
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kwkw

木虫 (著名写手)
★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
你加了DTT不影响蛋白质的活性吗？
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2楼2012-07-01 08:24:24
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strive123123

禁虫 (文坛精英)
★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
1949stone: 啥意思？ 2012-07-03 07:45:58
本帖内容被屏蔽
3楼2012-07-01 10:34:55
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八头小猪

铁杆木虫 (小有名气)
★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
你用的是什么菌种？什么质粒转化的？
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4楼2012-07-01 11:11:02
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675250244

银虫 (小有名气)
★ ★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-07-03 07:46:14
蛋白marker贴出来看看，我认为上面 的杂带不是目的蛋白的多聚体，跑电泳时煮过而且上样buffer中加了巯基乙醇是不可能形成多聚体的
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5楼2012-07-01 12:12:17
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 八头小猪 at 2012-07-01 11:11:02
你用的是什么菌种？什么质粒转化的？

Ecoli  ROSETTA的~ 28a的质粒
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6楼2012-07-01 14:22:24
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kwkw at 2012-07-01 08:24:24
你加了DTT不影响蛋白质的活性吗？

没有影响，我觉得可能是DTT部分打开了蛋白分子间的二硫键，一定程度稳定了蛋白，这样解释可能吗
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7楼2012-07-01 14:23:20
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 675250244 at 2012-07-01 12:12:17
蛋白marker贴出来看看，我认为上面 的杂带不是目的蛋白的多聚体，跑电泳时煮过而且上样buffer中加了巯基乙醇是不可能形成多聚体的

我觉得应该也煮开了啊~最下面的是我的目的条带，大概26KD 中间那条大概55KD, 上面的几个就难说了。。。。。
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8楼2012-07-01 14:25:29
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yingying1588

木虫之王 (文学泰斗)
★
loveskyzhou(金币+1): 谢谢参与
没有影响。
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9楼2012-07-01 21:51:03
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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1949stone: 金币+3, 可以多多交流 2012-07-03 07:46:42
引用回帖:
5楼: Originally posted by 675250244 at 2012-07-01 12:12:17
蛋白marker贴出来看看，我认为上面 的杂带不是目的蛋白的多聚体，跑电泳时煮过而且上样buffer中加了巯基乙醇是不可能形成多聚体的

确定电泳加了buffer经高温煮过，就不能形成多聚体了么？
因为我有一个蛋白，跑电泳的时候老是有二聚体在，我做质谱检测就是我的目的蛋白
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10楼2012-07-02 01:56:54
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 股交流 2012-07-03 15:21:17
lz，下面量最多的应该是你的目的蛋白吧，我感觉中间那个应该是你蛋白的二聚体或者其他具体，具体要看分子量
因为你点样太多，所以难免会有一些杂带，你可以尝试减少上样量，应该跑出来的效果就会好一些，你提取的蛋白主要是拿来做什么的呢？
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11楼2012-07-02 01:58:55
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-07-02 01:58:55
lz，下面量最多的应该是你的目的蛋白吧，我感觉中间那个应该是你蛋白的二聚体或者其他具体，具体要看分子量
因为你点样太多，所以难免会有一些杂带，你可以尝试减少上样量，应该跑出来的效果就会好一些，你提取的蛋 ...

做晶体，所以希望纯度高些，变性胶二聚应该解开了啊
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12楼2012-07-02 04:44:56
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kwkw at 2012-07-01 08:24:24
你加了DTT不影响蛋白质的活性吗？

少量dTT不会
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13楼2012-07-02 09:01:47
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by loveskyzhou at 2012-07-01 14:23:20
没有影响，我觉得可能是DTT部分打开了蛋白分子间的二硫键，一定程度稳定了蛋白，这样解释可能吗...

有这种可能
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14楼2012-07-02 09:02:14
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八头小猪

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
那可能是时间长了，质粒部分丢失
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15楼2012-07-02 23:25:43
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by loveskyzhou at 2012-07-02 04:44:56
做晶体，所以希望纯度高些，变性胶二聚应该解开了啊...


同道中人
恩，理论上是应该解开了，但是事实上确实就是二聚体，我做质谱检测过的
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16楼2012-07-03 00:50:23
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by loveskyzhou at 2012-07-02 04:44:56
做晶体，所以希望纯度高些，变性胶二聚应该解开了啊...

我不知道怎么发图，我就想给你看一下，我的电泳图是什么样子的，差不多跟你是一样的，目的蛋白特别的浓，上面有一条杂带，就是二聚体
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17楼2012-07-03 00:51:51
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-07-03 00:50:23

同道中人
恩，理论上是应该解开了，但是事实上确实就是二聚体，我做质谱检测过的...

有办法解开么这个？？
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18楼2012-07-03 07:39:12
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kukusnoopy

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by loveskyzhou at 2012-07-03 07:39:12
有办法解开么这个？？...

可以尝试煮的时间长一些，如果还是有聚体就用更强的还原剂TECP。
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19楼2012-07-03 10:36:35
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qianshengguo

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得可能是多聚体，加DTT还原不是就好多了嘛。
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20楼2012-07-03 22:52:12
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by kukusnoopy at 2012-07-03 10:36:35
可以尝试煮的时间长一些，如果还是有聚体就用更强的还原剂TECP。...

额。。。。我的意思是缓冲液条件下这个蛋白过分子筛好像有个小的多聚峰，好像是蛋白慢慢在聚啊？能不能减少这种情况呢
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21楼2012-07-04 18:34:30
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
好像就是啊，怎么回事呢
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22楼2012-07-05 09:08:58
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
若用镍柱纯化，是不是你的蛋白序列中存在类似组氨酸标签的结构，因此纯化的时候纯化下来了~交流一下！
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23楼2012-09-19 11:30:11
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