24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)

应助: 5 (幼儿园)
金币: 621.2
散金: 81
红花: 3
帖子: 243
在线: 125.3小时
虫号: 1417102
注册: 2011-09-25
性别: MM
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 简并引物需要加保护碱基吗

设计了简并引物，20个碱基。需要加保护碱基吗？

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

求高手设计简并引物已经有6人回复
兼并引物里边有多个兼并碱基好吗？已经有24人回复
引物加保护碱基已经有7人回复
关于PCR引物设计及添加酶切位点和保护碱基的问题已经有4人回复
自设简并引物几对，请高手帮检查下~~~ 已经有18人回复
计算引物退火温度时末端加的酶切位点计算在内吗？已经有5人回复
设计引物时酶切位点保护碱基的问题已经有8人回复
【求助/交流】限制性内切酶保护碱基已经有20人回复
【求助/交流】紧急求助~~ 关于简并引物设计 codehop 和genefisher 在线已经有12人回复
【求助/交流】所谓简并碱基已经有9人回复
【求助/交流】求AgeⅠ(BshTⅠ)的保护碱基用什么？已经有4人回复

nothing isimpossible

1楼 2012-06-12 19:53:01

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

qbf1988226

新虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 24.8
帖子: 3
在线: 49分钟
虫号: 1492796
注册: 2011-11-15
专业: 蛋白质组学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验，热心的虫虫 2012-06-14 13:36:57

不用，只要Tm值相近就行，其他的按照引物设计一般性原则
(1)长度：15—30bp，其有效长度[Ln＝2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。
(2)G十c含量：应在45％一55％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
(3)碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
(4)引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
(5)引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。
2．引物的3’端：引物的3’端很人程度上影响Taq酶的延伸效应，除特殊情况(AS－PCR)外，3’端不应发生错配。S.Kwok等发现，引物的3’端发生错配时，A：A使产量下降至l／20，A：G或C：C下降至1／100。当末位碱基是T时，即使错配也能引发链的合成，而为A时错配的引发效率最低，G、C居间。因此，引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。
此外，如果扩增编码区域，引物的3’端不要终止于密码了的第3位，因此处易发牛简并，从而影响扩增持异性。
3．避开引物的二级结构区：某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区，有些计算机软件可帮助确定该区域，如不能避开，则可用7－deaza－2’－脱氧GTP取代‘dGTP，有助干PCR成功。

很多时候不能完全符合上述的条件，用一些设计引物的软件来进行设计检查。我的感觉是大概就行，基本都能扩的出来