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简并引物需要加保护碱基吗
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| 设计了简并引物，20个碱基。需要加保护碱基吗？ |
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chenyhok1987
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验，热心的虫虫 2012-06-14 13:36:57
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不用，只要Tm值相近就行，其他的按照引物设计一般性原则 (1)长度：15—30bp，其有效长度[Ln＝2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。 (2)G十c含量：应在45％一55％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。 (3)碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。 (4)引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 (5)引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。 2．引物的3’端：引物的3’端很人程度上影响Taq酶的延伸效应，除特殊情况(AS－PCR)外，3’端不应发生错配。S.Kwok等发现，引物的3’端发生错配时，A：A使产量下降至l／20，A：G或C：C下降至1／100。当末位碱基是T时，即使错配也能引发链的合成，而为A时错配的引发效率最低，G、C居间。因此，引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。 此外，如果扩增编码区域，引物的3’端不要终止于密码了的第3位，因此处易发牛简并，从而影响扩增持异性。 3．避开引物的二级结构区：某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区，有些计算机软件可帮助确定该区域，如不能避开，则可用7－deaza－2’－脱氧GTP取代‘dGTP，有助干PCR成功。 很多时候不能完全符合上述的条件，用一些设计引物的软件来进行设计检查。我的感觉是大概就行，基本都能扩的出来 |
7楼2012-06-13 21:34:15
hyacinth326
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8楼2012-06-13 22:02:28
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