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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何提高连接效率呢？
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

[求助] 如何提高连接效率呢？

各位科研上的战友，大家帮我看看分析一下实验失败的原因。
我是从T载体上双酶切（酶为EcoR I和Sal I）下了我的目的片段，然后载体也已经用相同的酶的线性化，做到连接转化这一步老是不成功，很困惑。
连接体系是：
片段        6ul
线性化载体  2ul
T4ligase         1ul
buffer            1ul
total            10ul

16℃反应4h，4℃过夜，之后加100ul感受态。转化

在转化和感受态都是没问题的，因为做了对照试验。
我的浓度比基本都是看条带marker亮度估算的，没用相关仪器来检测准确浓度。
很多战友都说要不断摸索片段和载体的浓度比【这步是否需要呢？】。那这样是否需要很多次的连接转化呢？
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1楼 2012-05-28 16:16:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

chenyhok1987

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-30 13:42:10
载体与目的基因摩尔比是1：3到1：10之间，你每次根绝Marker估计一下DNA的质量，然后计算一下DNA的分子量，这么一比就是摩尔数的，这个比例在重组连接中是很关键的，我做的是一端平端一段粘端都是这样连接起来的，我一般采用大致1：10的比例。
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平生多磨砺，男儿自横行！
13楼2012-05-30 10:24:46
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普通回帖

yunocn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
比例很重要，一次连接可尝试3种比例
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2楼2012-05-28 17:17:27
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caohaojie316

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以一次尝试很多比例
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岂能皆尽人意，但求无愧我心！
3楼2012-05-28 21:47:49
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countingcrow

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流，这的确是需要注意的哦 2012-05-29 13:48:11
有几个问题：
1.  载体上ECOR I 和 Sal I 位点距离会不会太近？一般来说两个克隆位点如果相距太近，会影响酶切效率，导致只有一个位点切开。
2. 载体酶切时条件掌握得好不好，酶切时间会不会太短？如果酶切条件不好，会使载体酶切不完全。
3. 感受态细胞的体积是不是考虑搞多一些，否则酶切体系里的甘油会影响转化效率。
4. 载体的抗性基因是不是搞错了，是卡那抗性还是氨苄抗性。
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4楼2012-05-29 06:33:32
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yunocn at 2012-05-28 17:17:27
比例很重要，一次连接可尝试3种比例

请问一次连接怎么尝试多种比例呢？
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5楼2012-05-29 14:31:52
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by countingcrow at 2012-05-29 06:33:32
有几个问题：
1.  载体上ECOR I 和 Sal I 位点距离会不会太近？一般来说两个克隆位点如果相距太近，会影响酶切效率，导致只有一个位点切开。
2. 载体酶切时条件掌握得好不好，酶切时间会不会太短？如果酶切条件不 ...

T载体上的已经切下来了，而且效果很好的，表达载体是之前连接过其他的片段，所以也是双酶切切下来了，线性化好了，就是老是连接不上，我在想是不是比例的问题呢~？
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6楼2012-05-29 14:34:25
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-29 18:45:28
你好
我想知道你的感受态是大肠杆菌DH5α？用的什么方法做的感受态啊？

关于连接的问题，我也困惑，说的是3:1是最好的，但是这个比例是根据你测得浓度然后是要的摩尔数的比是3:1   我们实验室有人做的时候试的1:1 2:1 3:1    听说有的地方时9:1 10:1   你不妨试一下吧   我也在试着做不同比例
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7楼2012-05-29 15:12:10
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-05-29 15:12:10
你好
我想知道你的感受态是大肠杆菌DH5α？用的什么方法做的感受态啊？

关于连接的问题，我也困惑，说的是3:1是最好的，但是这个比例是根据你测得浓度然后是要的摩尔数的比是3:1   我们实验室有人做的时候试的1 ...

你好，谢谢你的回复，我的感受态是DH5α用的cacl2法做的感受态。我上分子实验课的时候也有说过，那个比例是根据片段大小和载体大小来计算的，但是我也不是很清楚哪个是最好，所以这样的实验只能是多做几次了，与君共勉吧~
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8楼2012-05-29 20:00:51
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wangzongda

新虫 (初入文坛)
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Jet wang
9楼2012-05-29 20:35:05
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-30 13:41:40
最大的可能就是你的目的基因片段和载体片段的比例不合适，还是多试试几个比例吧。我之前做过7ul目标片段和1ul载体片段的，不过这个还是要看你两个片段的浓度了。
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
10楼2012-05-29 21:42:16
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