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如何提高连接效率呢？
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各位科研上的战友，大家帮我看看分析一下实验失败的原因。 我是从T载体上双酶切（酶为EcoR I和Sal I）下了我的目的片段，然后载体也已经用相同的酶的线性化，做到连接转化这一步老是不成功，很困惑。 连接体系是： 片段 6ul 线性化载体 2ul T4ligase 1ul buffer 1ul total 10ul 16℃反应4h，4℃过夜，之后加100ul感受态。转化 在转化和感受态都是没问题的，因为做了对照试验。 我的浓度比基本都是看条带marker亮度估算的，没用相关仪器来检测准确浓度。 很多战友都说要不断摸索片段和载体的浓度比【这步是否需要呢？】。那这样是否需要很多次的连接转化呢？ |
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