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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 20
帖子: 36
在线: 10小时
虫号: 1314207
注册: 2011-06-03
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 如何提高连接效率呢？

各位科研上的战友，大家帮我看看分析一下实验失败的原因。
我是从T载体上双酶切（酶为EcoR I和Sal I）下了我的目的片段，然后载体也已经用相同的酶的线性化，做到连接转化这一步老是不成功，很困惑。
连接体系是：
片段       6ul
线性化载体  2ul
T4ligase       1ul
buffer          1ul
total          10ul

16℃反应4h，4℃过夜，之后加100ul感受态。转化

在转化和感受态都是没问题的，因为做了对照试验。
我的浓度比基本都是看条带marker亮度估算的，没用相关仪器来检测准确浓度。
很多战友都说要不断摸索片段和载体的浓度比【这步是否需要呢？】。那这样是否需要很多次的连接转化呢？

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1楼2012-05-28 16:16:22

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countingcrow

铁杆木虫 (小有名气)

应助: 9 (幼儿园)
金币: 7322.6
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红花: 3
帖子: 271
在线: 520.2小时
虫号: 1807081
注册: 2012-05-09
性别: GG
专业: 自身免疫性疾病

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流，这的确是需要注意的哦 2012-05-29 13:48:11

有几个问题：
1. 载体上ECOR I 和 Sal I 位点距离会不会太近？一般来说两个克隆位点如果相距太近，会影响酶切效率，导致只有一个位点切开。
2. 载体酶切时条件掌握得好不好，酶切时间会不会太短？如果酶切条件不好，会使载体酶切不完全。
3. 感受态细胞的体积是不是考虑搞多一些，否则酶切体系里的甘油会影响转化效率。
4. 载体的抗性基因是不是搞错了，是卡那抗性还是氨苄抗性。