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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 植物RNA的提取
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欢仔

银虫 (正式写手)

[求助] 植物RNA的提取

我在提富含多糖多酚的植物的RNA，提的效果不是很好，大家有什么好方法没

我在文献中查到了CTAB结合SDS法，这个方法如下我对其中的几个温度不太理解 请大侠们解释下吧  第二步中的提到的低温处理 起到了什么作用啊  大家也帮我看下这个方法有什么不合理的地方没   谢谢大家了
1  CTAB结合SDS法。分别称取叶片、叶柄和韧皮部各0.4 g于研钵中，加入0.05 g PVP，加入适量液氮，迅速研磨成粉末状，并将所有粉末全部转入2 mL离心管中；加入800 μL提取液（680 μL CTAB提取液、 80 μL 10%SDS、40 μL β-巯基乙醇；
CTAB 提取液成分为：2%CTAB、2.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L Tris、50 mmol/LEDTA），用力剧烈震荡使所有粉末均匀悬浮于提取液中；
2  [font=黑体]65℃水浴20 min，期间剧烈震荡，使其充分混合，水浴后将离心管迅速放入-80℃冰箱中低温处理2 h以上；
3  取出经低温处理后的混合物，将其置于45℃水浴10 min，期间轻轻震荡，使完全溶解；
4   4℃，12000 r/min 离心30 min，将上清液转入预冷的2 mL离心管中，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25:24:1，V/V/V)，在冰上用力振荡，使其充分混匀，
5  4℃，12000 r/min离心15 min（抽提2次），将上清液转入预冷过的1.5 mL离心管中，加入12 mol/L LiCl，使其终浓度为2 mol/L，冰上轻震荡充分混匀后置于-20℃条件下存放2 h以上；
6  4℃，12000 r/min 离心 10 min，去除上清液，加入 400 μL 预冷的75%的酒精清洗（重复2次）；室温下干燥15 min，加 20 μL DEPC-H2O 溶 解
进 行 下 一 步 试 验 或 置于-80℃冰箱中保存备用。
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勇于尝试新鲜事物
1楼 2012-05-13 14:51:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
16楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-05-23 00:35:52:
我是放在超净台上 用风吹几分钟

嗯..................
       嘿嘿 教你个更加有效的干燥方法：
       乙醇洗完后 倾倒掉大部分乙醇 后短暂离心 甩1-2s即可 使用100uL的移液枪套上黄枪头后再套10uL系列白枪头（这样主要是底下剩余的液体绝对比10uL多 但黄枪头开口大移液时肯定移不干净 同时可能粘乙醇到壁上） 需要用力攥紧（这里需要点技巧）这时候吸取底部残余乙醇 不用2分钟基本就能干透 避免了RNA长时间暴漏于空气中
       我基本上8个样品的话 吸掉最后一个样品的乙醇时第一个已经干透了
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Let God do with it as He wills
17楼2012-05-23 00:54:57
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-14 18:52:49
欢仔: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 非常感谢 2012-05-14 21:25:18
同意楼上的意见，可能要在操作上下点功夫。楼主所说的CTAB-SDS法，我只查到2012年中国农学通报上一篇关于葡萄的文章，不知楼主是否参考的这个。这种方法没见别的文献有报道，建议楼主参考时要谨慎。
多糖多酚类植物材料提RNA，我觉得主要需要添加一步抽提派出糖及酚的干扰，我手头收集的文献有建议使用70%丙酮抽提后用SDS-LiCl法提取。此外还有很多文献提出有用的建议，楼主不妨以比较可靠的经典方法做基础，参考这些文献自己摸索一下，不要盲目照着单一文献做。
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11楼2012-05-14 18:17:50
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 18:52:12
开始的65度水浴也是有助裂解细胞。
-80度低温处理然后又45度水浴应该是利用反复冻融以促进细胞裂解。个人认为植物如已经过液氮研磨来破碎细胞应该已很彻底，此步低温处理可选做。或楼主尝试作个对照实验看看有没有效果。
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伟大航线....
5楼2012-05-14 08:42:33
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longrna

新虫 (正式写手)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-14 18:52:24
效果时好时差？做同样的样品吗？如果是同样的样品效果时好时坏那很可能就是操作的问题。
如果是不同的样品，那很正常。不同的植物所含杂质不一样，用同样的方法肯定会出现对某些植物效果好，而对某些植物效果差的情况。
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伟大航线....
10楼2012-05-14 17:18:16
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)
我最近也在提RNA，如果除糖的话，加入KAc抽提下比较好；还有就是含酚多，那在酚、氯仿抽提后应该再用氯仿抽提，除酚的效果较好。以上意见仅供参考
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13楼2012-05-15 09:01:38
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普通回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
欢仔: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-05-13 23:56:41
65度水浴这步主要起到裂解细胞，释放出核酸的作用。在提取RNA过程中建议不要剧烈震动，适当振摇即可。
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2楼2012-05-13 22:32:57
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-13 22:32:57:
65度水浴这步主要起到裂解细胞，释放出核酸的作用。在提取RNA过程中建议不要剧烈震动，适当振摇即可。

那后面放到-80度 冰箱低温处理2h  起到什么作用 -80不是都结冰了吗 很费解
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勇于尝试新鲜事物
3楼2012-05-13 23:56:14
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-05-13 23:56:14:
那后面放到-80度 冰箱低温处理2h  起到什么作用 -80不是都结冰了吗 很费解

低温处理的作用主要是让核酸析出沉淀，为什么-80度我也不理解，楼主从哪里看到这个方法？
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4楼2012-05-14 00:23:38
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c19345174

银虫 (初入文坛)
请问楼主提的效果不好具体指什么？最好能附上电泳图！
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6楼2012-05-14 13:08:24
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2012-05-14 08:42:33:
开始的65度水浴也是有助裂解细胞。
-80度低温处理然后又45度水浴应该是利用反复冻融以促进细胞裂解。个人认为植物如已经过液氮研磨来破碎细胞应该已很彻底，此步低温处理可选做。或楼主尝试作个对照实验看看有没 ...

嗯嗯 好的
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勇于尝试新鲜事物
7楼2012-05-14 14:44:07
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-14 00:23:38:
低温处理的作用主要是让核酸析出沉淀，为什么-80度我也不理解，楼主从哪里看到这个方法？

我是从文献中看到的  
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勇于尝试新鲜事物
8楼2012-05-14 14:44:32
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by c19345174 at 2012-05-14 13:08:24:
请问楼主提的效果不好具体指什么？最好能附上电泳图！

哦 是这样 我以前是用SDS-licl 提的 效果不好主要是指 一次实验中有的样品还可以 有的却很差  有的时好有的时候很差 所以想试下别的方法
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勇于尝试新鲜事物
9楼2012-05-14 14:48:41
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