应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 酰胺酶的筛选方法
151/1返回列表
查看: 2071  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hraikeyan

金虫 (小有名气)

[交流] 酰胺酶的筛选方法

各位大侠，最近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立，就是没有一个高效有效的筛选方法，不知有没有谁做过这方面的研究，能否指点一二。
ps：底物为内酰胺，被酶水解后变为氨基酸
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-05-12 21:27:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-09-13 14:18:05
引用回帖:
5楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-05-15 14:20:21
用茚三酮显色法我们考虑过，具体是在一个文献上看到的，将构建的基因文库转化涂平板，在用沾有底物的滤纸沾平板上的菌落，使其反应一段时间后再用该滤纸沾用茚三酮湿润的滤纸，但结果是所有的印迹都显色。分析原因 ...

不好意思，可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
最近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high-throughput screening strategy for nitrile-hydrolyzing enzymes based on ferric hydroxamate spectrophotometry. Appl Microbiol Biotechnol 89: 817-823.
介绍了一种高通量筛选的较为灵敏 可以排除较多干扰的方法。。你稍微看看是否有参考价值？
另外，建议你可以多查查羧酸特异的颜色反应，这方面文献貌似更多一些，可行性估计也更高。做的人多。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2012-09-12 22:09:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
hraikeyan: 金币+2, 好的，我先好好想想实验思路，如果真的打算构建基因文库，到时还有很多问题要请教您。我们实验室还没人做过呢！压力比较大啊！ 2012-09-13 21:01:41
引用回帖:
6楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-09-11 23:18:10
你好，我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应，但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落，进行一个一颜色反应，这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法 ...

我们这边有做文库的还真这么干， 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上，当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑，筛选了上万个克隆。。。
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2012-09-12 22:11:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-09-13 15:54:01
谢谢你...

客气了  实验慢慢来吧。开始都很艰难的，因为没接触过。耐着性子做，功到自然成。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2012-09-13 23:25:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

huangju0305

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:45
你的问题有点模糊，你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗？如果是的话，那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值，或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见，还望各位大侠指教。
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-14 09:22:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenlin0514

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:55
你可以做一个酶偶联筛选方案，即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后，再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应，生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应，就可以进行筛选。
不过筛选方法最重要的稳定性和重复性，即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%，否则没有意义。
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-14 10:33:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-14 22:50:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gjs713 at 2012-05-14 22:50:03:
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。

用茚三酮显色法我们考虑过，具体是在一个文献上看到的，将构建的基因文库转化涂平板，在用沾有底物的滤纸沾平板上的菌落，使其反应一段时间后再用该滤纸沾用茚三酮湿润的滤纸，但结果是所有的印迹都显色。分析原因是每个菌落中都含有氨基酸，这样做不能排除其他氨基酸的干扰，不知您有什么好的办法排除干扰吗？
赞一下 回复此楼
5楼2012-05-15 14:20:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gjs713 at 2012-05-14 22:50:03
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。

你好，我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应，但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落，进行一个一颜色反应，这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法？
赞一下 回复此楼
6楼2012-09-11 23:18:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gjs713 at 2012-09-12 22:09:50
不好意思，可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
最近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high ...

谢谢你
回复此楼
9楼2012-09-13 15:54:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gjs713 at 2012-09-12 22:11:17
我们这边有做文库的还真这么干， 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上，当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑，筛选了上万个克隆。。。...

您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？最后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您们是用96孔板做的吗？
3：我的目标基因片段应该在1500bp左右，回收2-9kb的基因片段可以吗？
4：我是根据酶活筛选的，但是一些根据活性筛选的基因文库的文献中采用puc19做载体，DH5α做宿主，这些不是克隆载体和克隆用的感受态吗？能用来做活性筛选用吗？
问题有些多，谢谢啦！如果有问题还得请教啊！
好人~~~
赞一下 回复此楼
11楼2012-10-30 16:49:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gjs713 at 2012-09-12 22:09:50
不好意思，可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
最近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high ...

您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？最后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您们是用96孔板做的吗？
3：我的目标基因片段应该在1500bp左右，回收2-9kb的基因片段可以吗？
4：我是根据酶活筛选的，但是一些根据活性筛选的基因文库的文献中采用puc19做载体，DH5α做宿主，这些不是克隆载体和克隆用的感受态吗？能用来做活性筛选用吗？
问题有些多，谢谢啦！如果有问题还得请教啊！
好人~~~
赞一下 回复此楼
12楼2012-10-31 12:55:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:14:56
引用回帖:
11楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-10-30 16:49:26
您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？最后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您 ...

1 这个博士是我们隔壁实验室的 已经毕业了多年了。他做的酶比较难筛  估计做了一年吧。你是刚进研二 还是 研二已经结束了？时间问题要考虑。
2 是96孔板
3 可以的，最后可以做亚克隆
4 嗯 是的。但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。
赞一下 回复此楼
13楼2012-10-31 14:24:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by gjs713 at 2012-10-31 14:24:49
1 这个博士是我们隔壁实验室的 已经毕业了多年了。他做的酶比较难筛  估计做了一年吧。你是刚进研二 还是 研二已经结束了？时间问题要考虑。
2 是96孔板
3 可以的，最后可以做亚克隆
4 嗯 是的。但是这样还得做 ...

我刚进研二，应该还有一年时间吧。
您说“但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。“是说用克隆载体做完构建好文库后，还要把片段切下来，连接到表达载体上，导入表达细胞进行表达吗？还是直接加诱导剂就可以表达？
赞一下 回复此楼
14楼2012-10-31 16:42:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-10-31 16:42:55
我刚进研二，应该还有一年时间吧。
您说“但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。“是说用克隆载体做完构建好文库后，还要把片段切下来，连接到表达载体上，导入表达细胞进行表达吗？还是直接加诱导剂就可以 ...

对啊  直接表达更省事点
赞一下 回复此楼
15楼2012-10-31 19:43:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hraikeyan 的主题更新
151/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭