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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 酰胺酶的筛选方法
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[交流] 酰胺酶的筛选方法

各位大侠，最近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立，就是没有一个高效有效的筛选方法，不知有没有谁做过这方面的研究，能否指点一二。
ps：底物为内酰胺，被酶水解后变为氨基酸
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1楼 2012-05-12 21:27:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-09-13 14:18:05
引用回帖:
5楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-05-15 14:20:21
用茚三酮显色法我们考虑过，具体是在一个文献上看到的，将构建的基因文库转化涂平板，在用沾有底物的滤纸沾平板上的菌落，使其反应一段时间后再用该滤纸沾用茚三酮湿润的滤纸，但结果是所有的印迹都显色。分析原因 ...

不好意思，可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
最近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high-throughput screening strategy for nitrile-hydrolyzing enzymes based on ferric hydroxamate spectrophotometry. Appl Microbiol Biotechnol 89: 817-823.
介绍了一种高通量筛选的较为灵敏 可以排除较多干扰的方法。。你稍微看看是否有参考价值？
另外，建议你可以多查查羧酸特异的颜色反应，这方面文献貌似更多一些，可行性估计也更高。做的人多。
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7楼2012-09-12 22:09:50
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
hraikeyan: 金币+2, 好的，我先好好想想实验思路，如果真的打算构建基因文库，到时还有很多问题要请教您。我们实验室还没人做过呢！压力比较大啊！ 2012-09-13 21:01:41
引用回帖:
6楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-09-11 23:18:10
你好，我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应，但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落，进行一个一颜色反应，这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法 ...

我们这边有做文库的还真这么干， 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上，当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑，筛选了上万个克隆。。。
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8楼2012-09-12 22:11:17
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-09-13 15:54:01
谢谢你...

客气了  实验慢慢来吧。开始都很艰难的，因为没接触过。耐着性子做，功到自然成。
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10楼2012-09-13 23:25:36
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huangju0305

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:45
你的问题有点模糊，你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗？如果是的话，那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值，或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见，还望各位大侠指教。
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2楼2012-05-14 09:22:25
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shenlin0514

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:55
你可以做一个酶偶联筛选方案，即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后，再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应，生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应，就可以进行筛选。
不过筛选方法最重要的稳定性和重复性，即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%，否则没有意义。
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3楼2012-05-14 10:33:34
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。
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4楼2012-05-14 22:50:03
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gjs713 at 2012-05-14 22:50:03:
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。

用茚三酮显色法我们考虑过，具体是在一个文献上看到的，将构建的基因文库转化涂平板，在用沾有底物的滤纸沾平板上的菌落，使其反应一段时间后再用该滤纸沾用茚三酮湿润的滤纸，但结果是所有的印迹都显色。分析原因是每个菌落中都含有氨基酸，这样做不能排除其他氨基酸的干扰，不知您有什么好的办法排除干扰吗？
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5楼2012-05-15 14:20:21
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gjs713 at 2012-05-14 22:50:03
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。

你好，我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应，但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落，进行一个一颜色反应，这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法？
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6楼2012-09-11 23:18:10
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gjs713 at 2012-09-12 22:09:50
不好意思，可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
最近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high ...

谢谢你
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9楼2012-09-13 15:54:01
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gjs713 at 2012-09-12 22:11:17
我们这边有做文库的还真这么干， 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上，当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑，筛选了上万个克隆。。。...

您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？最后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您们是用96孔板做的吗？
3：我的目标基因片段应该在1500bp左右，回收2-9kb的基因片段可以吗？
4：我是根据酶活筛选的，但是一些根据活性筛选的基因文库的文献中采用puc19做载体，DH5α做宿主，这些不是克隆载体和克隆用的感受态吗？能用来做活性筛选用吗？
问题有些多，谢谢啦！如果有问题还得请教啊！
好人~~~
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11楼2012-10-30 16:49:26
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by gjs713 at 2012-09-12 22:09:50
不好意思，可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
最近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high ...

您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？最后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您们是用96孔板做的吗？
3：我的目标基因片段应该在1500bp左右，回收2-9kb的基因片段可以吗？
4：我是根据酶活筛选的，但是一些根据活性筛选的基因文库的文献中采用puc19做载体，DH5α做宿主，这些不是克隆载体和克隆用的感受态吗？能用来做活性筛选用吗？
问题有些多，谢谢啦！如果有问题还得请教啊！
好人~~~
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12楼2012-10-31 12:55:07
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:14:56
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11楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-10-30 16:49:26
您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？最后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您 ...

1 这个博士是我们隔壁实验室的 已经毕业了多年了。他做的酶比较难筛  估计做了一年吧。你是刚进研二 还是 研二已经结束了？时间问题要考虑。
2 是96孔板
3 可以的，最后可以做亚克隆
4 嗯 是的。但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。
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13楼2012-10-31 14:24:49
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by gjs713 at 2012-10-31 14:24:49
1 这个博士是我们隔壁实验室的 已经毕业了多年了。他做的酶比较难筛  估计做了一年吧。你是刚进研二 还是 研二已经结束了？时间问题要考虑。
2 是96孔板
3 可以的，最后可以做亚克隆
4 嗯 是的。但是这样还得做 ...

我刚进研二，应该还有一年时间吧。
您说“但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。“是说用克隆载体做完构建好文库后，还要把片段切下来，连接到表达载体上，导入表达细胞进行表达吗？还是直接加诱导剂就可以表达？
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14楼2012-10-31 16:42:55
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-10-31 16:42:55
我刚进研二，应该还有一年时间吧。
您说“但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。“是说用克隆载体做完构建好文库后，还要把片段切下来，连接到表达载体上，导入表达细胞进行表达吗？还是直接加诱导剂就可以 ...

对啊  直接表达更省事点
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15楼2012-10-31 19:43:06
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