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酰胺酶的筛选方法
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hraikeyan
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[交流]
酰胺酶的筛选方法
各位大侠,最近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立,就是没有一个高效有效的筛选方法,不知有没有谁做过这方面的研究,能否指点一二。
ps:底物为内酰胺,被酶水解后变为氨基酸
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1楼
2012-05-12 21:27:22
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gjs713
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★ ★
hraikeyan: 金币+2, 好的,我先好好想想实验思路,如果真的打算构建基因文库,到时还有很多问题要请教您。我们实验室还没人做过呢!压力比较大啊!
2012-09-13 21:01:41
引用回帖:
6楼
:
Originally posted by
hraikeyan
at 2012-09-11 23:18:10
你好,我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应,但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落,进行一个一颜色反应,这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法 ...
我们这边有做文库的还真这么干, 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上,当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑,筛选了上万个克隆。。。
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8楼
2012-09-12 22:11:17
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huangju0305
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hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流
2012-05-14 13:45:45
你的问题有点模糊,你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗?如果是的话,那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值,或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见,还望各位大侠指教。
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2楼
2012-05-14 09:22:25
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shenlin0514
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★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流
2012-05-14 13:45:55
你可以做一个酶偶联筛选方案,即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后,再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应,生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应,就可以进行筛选。
不过筛选方法最重要的稳定性和重复性,即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%,否则没有意义。
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3楼
2012-05-14 10:33:34
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gjs713
至尊木虫
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★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过,采用茚三酮反应来进行筛选,大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。
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4楼
2012-05-14 22:50:03
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