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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 酰胺酶的筛选方法
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[交流] 酰胺酶的筛选方法

各位大侠，最近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立，就是没有一个高效有效的筛选方法，不知有没有谁做过这方面的研究，能否指点一二。
ps：底物为内酰胺，被酶水解后变为氨基酸
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1楼 2012-05-12 21:27:22
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
hraikeyan: 金币+2, 好的，我先好好想想实验思路，如果真的打算构建基因文库，到时还有很多问题要请教您。我们实验室还没人做过呢！压力比较大啊！ 2012-09-13 21:01:41
引用回帖:
6楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-09-11 23:18:10
你好，我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应，但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落，进行一个一颜色反应，这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法 ...

我们这边有做文库的还真这么干， 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上，当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑，筛选了上万个克隆。。。
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8楼2012-09-12 22:11:17
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huangju0305

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:45
你的问题有点模糊，你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗？如果是的话，那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值，或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见，还望各位大侠指教。
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2楼2012-05-14 09:22:25
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shenlin0514

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:55
你可以做一个酶偶联筛选方案，即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后，再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应，生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应，就可以进行筛选。
不过筛选方法最重要的稳定性和重复性，即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%，否则没有意义。
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3楼2012-05-14 10:33:34
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。
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4楼2012-05-14 22:50:03
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