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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 酰胺酶的筛选方法
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[交流] 酰胺酶的筛选方法

各位大侠，最近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立，就是没有一个高效有效的筛选方法，不知有没有谁做过这方面的研究，能否指点一二。
ps：底物为内酰胺，被酶水解后变为氨基酸
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1楼 2012-05-12 21:27:22
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。
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4楼2012-05-14 22:50:03
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huangju0305

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:45
你的问题有点模糊，你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗？如果是的话，那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值，或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见，还望各位大侠指教。
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2楼2012-05-14 09:22:25
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shenlin0514

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:45:55
你可以做一个酶偶联筛选方案，即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后，再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应，生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应，就可以进行筛选。
不过筛选方法最重要的稳定性和重复性，即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%，否则没有意义。
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3楼2012-05-14 10:33:34
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gjs713 at 2012-05-14 22:50:03:
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。

用茚三酮显色法我们考虑过，具体是在一个文献上看到的，将构建的基因文库转化涂平板，在用沾有底物的滤纸沾平板上的菌落，使其反应一段时间后再用该滤纸沾用茚三酮湿润的滤纸，但结果是所有的印迹都显色。分析原因是每个菌落中都含有氨基酸，这样做不能排除其他氨基酸的干扰，不知您有什么好的办法排除干扰吗？
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5楼2012-05-15 14:20:21
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