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酰胺酶的筛选方法
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查看: 2022 | 回复: 14
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hraikeyan
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[交流]
酰胺酶的筛选方法
各位大侠,最近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立,就是没有一个高效有效的筛选方法,不知有没有谁做过这方面的研究,能否指点一二。
ps:底物为内酰胺,被酶水解后变为氨基酸
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2012-05-12 21:27:22
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gjs713
至尊木虫
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
14楼
:
Originally posted by
hraikeyan
at 2012-10-31 16:42:55
我刚进研二,应该还有一年时间吧。
您说“但是这样还得做一次表达,增加了一倍工作量。“是说用克隆载体做完构建好文库后,还要把片段切下来,连接到表达载体上,导入表达细胞进行表达吗?还是直接加诱导剂就可以 ...
对啊 直接表达更省事点
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15楼
2012-10-31 19:43:06
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huangju0305
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hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
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2012-05-14 13:45:45
你的问题有点模糊,你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗?如果是的话,那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值,或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见,还望各位大侠指教。
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2楼
2012-05-14 09:22:25
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shenlin0514
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hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流
2012-05-14 13:45:55
你可以做一个酶偶联筛选方案,即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后,再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应,生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应,就可以进行筛选。
不过筛选方法最重要的稳定性和重复性,即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%,否则没有意义。
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3楼
2012-05-14 10:33:34
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gjs713
至尊木虫
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★
hraikeyan(金币+1): 谢谢参与
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过,采用茚三酮反应来进行筛选,大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。
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4楼
2012-05-14 22:50:03
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