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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？

各位朋友好！最近做定量PCR遇到了点问题，仪器是ABI7300，在延伸步骤读取荧光值会有非特征峰，所以想在后面加一步高温步骤（约80-85度）读取荧光值，想问一下通常这一步需要保持多长时间？谢谢！
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1楼2012-05-09 09:19:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 13:55:14
tingspdf: 金币+2 2012-05-12 14:51:15
我觉得按照你实验的步骤设计吗，30s就行啊，或者短一点，15s左右，这一步只是读数据，关键还是你设计的温度，从溶解曲线可以看出你温度越高，值就越小这是一定的，所以温度是很重要的。实验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-09 10:44:25
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, 学习了哈~ 2012-05-10 03:59:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-09 21:21:18:
这样是不行的哦。有非特异峰就代表有非特异扩增，如果你是两步法（退火、延伸用同一个温度），可以改为传统的三步法以增加特异性。也可以尝试提高退火温度。
如果你用的荧光染料是sybr green，只能在延伸结束时检 ...

西瓜大哥哦
有非特异峰值还有可能是管子的问题哦 我们经常遇到的 有些公司的96孔板会有非特异性扩增 换成好些的8-strips tube就没啥问题了
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Let God do with it as He wills
4楼2012-05-09 23:48:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
后面的峰肯定不是引物二聚体了，解链温度这么高。可能是非特异扩增，你可以跑个电泳看看有没有条带。个人意见，仅供参考哈
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12楼2012-05-20 23:39:43
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 斑斑很辛苦哈 2012-05-10 13:40:22
tingspdf: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-12 14:56:12
这样是不行的哦。有非特异峰就代表有非特异扩增，如果你是两步法（退火、延伸用同一个温度），可以改为传统的三步法以增加特异性。也可以尝试提高退火温度。
如果你用的荧光染料是sybr green，只能在延伸结束时检测荧光信号，额外增加一个专门检测荧光的步骤是不可行的哦。
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3楼2012-05-09 21:21:18
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-09 23:48:17:
西瓜大哥哦
有非特异峰值还有可能是管子的问题哦 我们经常遇到的 有些公司的96孔板会有非特异性扩增 换成好些的8-strips tube就没啥问题了

呵呵，还有这回事啊，学习啦~
琴美同学当真是经验丰富的高手啊
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5楼2012-05-10 03:59:36
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-09 21:21:18:
这样是不行的哦。有非特异峰就代表有非特异扩增，如果你是两步法（退火、延伸用同一个温度），可以改为传统的三步法以增加特异性。也可以尝试提高退火温度。
如果你用的荧光染料是sybr green，只能在延伸结束时检 ...

版主您好，我用的确实是SYBR green, 三步法的结果不太理想，标线斜率-2.22...相当于极其高的扩增效率，遂改成两步法在实验，我们周围有加一步专门检测荧光的步骤，效果还不错，呵呵，所以才在此询问一下各位。
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6楼2012-05-12 14:53:45
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-09 23:48:17:
西瓜大哥哦
有非特异峰值还有可能是管子的问题哦 我们经常遇到的 有些公司的96孔板会有非特异性扩增 换成好些的8-strips tube就没啥问题了

谢谢琴美的回复！我用的是ABI的8-strips管子，绝对没有问题
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7楼2012-05-12 14:54:45
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-09 10:44:25:
我觉得按照你实验的步骤设计吗，30s就行啊，或者短一点，15s左右，这一步只是读数据，关键还是你设计的温度，从溶解曲线可以看出你温度越高，值就越小这是一定的，所以温度是很重要的。实验顺利啊

谢谢您的回复！ "从溶解曲线可以看出你温度越高，值就越小这是一定的" 这句话是什么意思？ 您说得是保持时间还是温度设定值？
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8楼2012-05-12 14:56:02
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 斑斑太谦虚了 2012-05-12 15:43:57
tingspdf: 金币+2, ★★★很有帮助, 72度读荧光应该可以避免引物二聚体的干扰吧？ 2012-05-12 22:19:56
引用回帖:
6楼: Originally posted by tingspdf at 2012-05-12 14:53:45:
版主您好，我用的确实是SYBR green, 三步法的结果不太理想，标线斜率-2.22...相当于极其高的扩增效率，遂改成两步法在实验，我们周围有加一步专门检测荧光的步骤，效果还不错，呵呵，所以才在此询问一下各位。

呵呵，不好意思，孤陋寡闻了，之前没听说过有这么做的
刚看了下天根的资料，有提到如果有引物二聚体怎么处理，其中一个方法是“在延伸反应结束之后加上一个温度（高于引物二聚体解链温度而低于目的片段解链温度）延伸数秒。”我没做过，引号内是他们原文哈。

下面是个人看法，欢迎各位指正：
我想这跟你打算用的方法应该是一个意思吧。原理我想应该是这样：Sybr Green只能检测双链，所以提高温度让非特异结合解链而保持目的片段不解链，这时候检测荧光信号的话就没有非特异产物的信号了。具体取几度，应该可以参照熔解曲线，取特异产物的峰和非特异产物的峰中间的温度就可以了。至于时间，他们说几秒钟，个人认为是合理的：很多PCR程序的变性时间只需要20秒左右，非特异产物结合的强度肯定不及模板（因为远远比模板短），模板解链需要的时间都这么短，要搞定非特异产物几秒钟应该足矣。

如果还是不行，建议还是换引物吧。

[ Last edited by 西瓜 on 2012-5-12 at 15:56 ]
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9楼2012-05-12 15:39:48
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

72℃估计还不够，这只是普通延伸的温度啊。我自己做的荧光定量，目的片段在熔解曲线上的峰对应的温度一般在80~85℃之间，我觉得这个温度可以在80度上下。我还是上一个回复那个意思：具体取几度，应该可以参照熔解曲线，取特异产物的峰和非特异产物的峰中间的温度就可以了。
或者你上个熔解曲线图，我们一起讨论下，呵呵
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10楼2012-05-12 22:34:50
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