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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？

各位朋友好！最近做定量PCR遇到了点问题，仪器是ABI7300，在延伸步骤读取荧光值会有非特征峰，所以想在后面加一步高温步骤（约80-85度）读取荧光值，想问一下通常这一步需要保持多长时间？谢谢！
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1楼 2012-05-09 09:19:27
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
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3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-09 21:21:18:
这样是不行的哦。有非特异峰就代表有非特异扩增，如果你是两步法（退火、延伸用同一个温度），可以改为传统的三步法以增加特异性。也可以尝试提高退火温度。
如果你用的荧光染料是sybr green，只能在延伸结束时检 ...

版主您好，我用的确实是SYBR green, 三步法的结果不太理想，标线斜率-2.22...相当于极其高的扩增效率，遂改成两步法在实验，我们周围有加一步专门检测荧光的步骤，效果还不错，呵呵，所以才在此询问一下各位。
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6楼2012-05-12 14:53:45
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
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4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-09 23:48:17:
西瓜大哥哦
有非特异峰值还有可能是管子的问题哦 我们经常遇到的 有些公司的96孔板会有非特异性扩增 换成好些的8-strips tube就没啥问题了

谢谢琴美的回复！我用的是ABI的8-strips管子，绝对没有问题
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7楼2012-05-12 14:54:45
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
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2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-09 10:44:25:
我觉得按照你实验的步骤设计吗，30s就行啊，或者短一点，15s左右，这一步只是读数据，关键还是你设计的温度，从溶解曲线可以看出你温度越高，值就越小这是一定的，所以温度是很重要的。实验顺利啊

谢谢您的回复！ "从溶解曲线可以看出你温度越高，值就越小这是一定的" 这句话是什么意思？ 您说得是保持时间还是温度设定值？
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8楼2012-05-12 14:56:02
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
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10楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-12 22:34:50:
72℃估计还不够，这只是普通延伸的温度啊。我自己做的荧光定量，目的片段在熔解曲线上的峰对应的温度一般在80~85℃之间，我觉得这个温度可以在80度上下。我还是上一个回复那个意思：具体取几度，应该可以参照熔解 ...

斑竹您好，这是我用三步法扩增时得到的溶解曲线，设置在72度读数，不过后面有个小峰，我不知道会不会影响最后的读数，我总共做了几十个样本，只有这四个（平行样）后面有小峰。。。能否给点意见？是否需要重新做一下？
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11楼2012-05-20 23:06:35
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