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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr退火时间
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] pcr退火时间

大家好，请教一个pcr的问题。我的引物长度约为70多个bp，那么在设计程序的时候，引物的退火时间大概要多长呢，谢谢！
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1楼 2012-05-08 20:56:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
thestormcong: 回帖置顶 2012-05-09 21:08:50
引用回帖:
17楼: Originally posted by thestormcong at 2012-05-09 20:12:20:
可是二次pcr的效果总是不那么好。无奈。

你是用PCR产物为模板，再用同样的引物进行扩增吗？这样扩增不好是很正常的。DNA聚合酶需要一些额外的碱基才能稳定结合DNA模板，扩增才好，一般十几个bp就够了。你可以设计两对引物，第一对扩增的产物在两端都比实际需要的片段长十几个bp（几十、上百bp都没问题，但是片段太长会加大扩增难度）。以此为模板进行第二次PCR，用第二对引物把你真正要的片段再扩增出来。说白了就是巢式PCR：http://baike.baidu.com/view/688277.htm
第一轮PCR的产物要求很低，有目的条带就好，杂带、弥散这些都无所谓，第二轮PCR后就能得到特异条带啦。
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18楼2012-05-09 20:27:44
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-08 21:14:30:
退火时间主要看你要扩增多大的片段，已经用什么酶。
taq酶一般是按一分钟1000bp算

这个是延伸时间，才按照这1000bp一分钟算的，退火温度是看引物的，可以长一点
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总有一天我要修改用户名。
15楼2012-05-09 16:28:46
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普通回帖

jmmchen

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物越长，退火时间应稍微长一些，1min左右应该可以。
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thestormcong
面朝大海，春暖花开
2楼2012-05-08 21:09:32
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 18:56:21
Tm=4（G+C）+2(A+T),Tm值比退火温度高5-15度。
退火温度一般为55度-60度，GC<50％,一般用55度；GC>50％，一般用60度。若有非特异性带，可提高退火温度，但最好不要高于68度，合适的退火温度在45-68度。
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thestormcong
未来不是梦
3楼2012-05-08 21:12:58
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 呵呵，我一般也这么算的 2012-05-09 13:56:46
退火时间主要看你要扩增多大的片段，已经用什么酶。
taq酶一般是按一分钟1000bp算
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未来不是梦
4楼2012-05-08 21:14:30
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流~白猫很给力~~ 2012-05-09 18:56:50
退火时间是与引物的长度有关的，70bp的时间就长点呗，如果温度不确定的话就做个温度梯度
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5楼2012-05-08 21:18:21
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thestormcong

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by jmmchen at 2012-05-08 21:09:32:
引物越长，退火时间应稍微长一些，1min左右应该可以。

好的，谢谢你的回答。
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6楼2012-05-08 21:40:03
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thestormcong

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-08 21:12:58:
Tm=4（G+C）+2(A+T),Tm值比退火温度高5-15度。
退火温度一般为55度-60度，GC<50％,一般用55度；GC>50％，一般用60度。若有非特异性带，可提高退火温度，但最好不要高于68度，合适的退火温度在45-68度。

谢谢哈！
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7楼2012-05-08 21:40:19
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-05-08 21:18:21:
退火时间是与引物的长度有关的，70bp的时间就长点呗，如果温度不确定的话就做个温度梯度

谢谢
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8楼2012-05-08 21:40:33
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linyanfei

铜虫 (小有名气)
LZ是做什么实验呀？引物需要那么长的吗？
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9楼2012-05-08 21:41:19
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thestormcong

银虫 (小有名气)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-09 18:57:05
引用回帖:
9楼: Originally posted by linyanfei at 2012-05-08 21:41:19:
LZ是做什么实验呀？引物需要那么长的吗？

我做基因敲除的，引物上有同源臂，扩增了一轮之后，浓度不够，想再扩增一轮增大浓度，所以第二轮的引物就变的这么长了。
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10楼2012-05-08 21:50:47
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