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thestormcong银虫 (小有名气)
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[求助]
pcr退火时间
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| 大家好，请教一个pcr的问题。我的引物长度约为70多个bp，那么在设计程序的时候，引物的退火时间大概要多长呢，谢谢！ |
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thestormcong
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10楼2012-05-08 21:50:47
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thestormcong: 回帖置顶 2012-05-09 21:08:50
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你是用PCR产物为模板，再用同样的引物进行扩增吗？这样扩增不好是很正常的。DNA聚合酶需要一些额外的碱基才能稳定结合DNA模板，扩增才好，一般十几个bp就够了。你可以设计两对引物，第一对扩增的产物在两端都比实际需要的片段长十几个bp（几十、上百bp都没问题，但是片段太长会加大扩增难度）。以此为模板进行第二次PCR，用第二对引物把你真正要的片段再扩增出来。说白了就是巢式PCR：http://baike.baidu.com/view/688277.htm 第一轮PCR的产物要求很低，有目的条带就好，杂带、弥散这些都无所谓，第二轮PCR后就能得到特异条带啦。 |
18楼2012-05-09 20:27:44
15楼2012-05-09 16:28:46
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thestormcong2楼2012-05-08 21:09:32
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Tm=4（G+C）+2(A+T),Tm值比退火温度高5-15度。 退火温度一般为55度-60度，GC<50％,一般用55度；GC>50％，一般用60度。若有非特异性带，可提高退火温度，但最好不要高于68度，合适的退火温度在45-68度。 |
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3楼2012-05-08 21:12:58
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