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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr退火时间
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] pcr退火时间

大家好，请教一个pcr的问题。我的引物长度约为70多个bp，那么在设计程序的时候，引物的退火时间大概要多长呢，谢谢！
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1楼 2012-05-08 20:56:15
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
thestormcong: 回帖置顶 2012-05-09 21:08:50
引用回帖:
17楼: Originally posted by thestormcong at 2012-05-09 20:12:20:
可是二次pcr的效果总是不那么好。无奈。

你是用PCR产物为模板，再用同样的引物进行扩增吗？这样扩增不好是很正常的。DNA聚合酶需要一些额外的碱基才能稳定结合DNA模板，扩增才好，一般十几个bp就够了。你可以设计两对引物，第一对扩增的产物在两端都比实际需要的片段长十几个bp（几十、上百bp都没问题，但是片段太长会加大扩增难度）。以此为模板进行第二次PCR，用第二对引物把你真正要的片段再扩增出来。说白了就是巢式PCR：http://baike.baidu.com/view/688277.htm
第一轮PCR的产物要求很低，有目的条带就好，杂带、弥散这些都无所谓，第二轮PCR后就能得到特异条带啦。
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18楼2012-05-09 20:27:44
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jmmchen

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物越长，退火时间应稍微长一些，1min左右应该可以。
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thestormcong
面朝大海，春暖花开
2楼2012-05-08 21:09:32
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 18:56:21
Tm=4（G+C）+2(A+T),Tm值比退火温度高5-15度。
退火温度一般为55度-60度，GC<50％,一般用55度；GC>50％，一般用60度。若有非特异性带，可提高退火温度，但最好不要高于68度，合适的退火温度在45-68度。
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thestormcong
未来不是梦
3楼2012-05-08 21:12:58
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 呵呵，我一般也这么算的 2012-05-09 13:56:46
退火时间主要看你要扩增多大的片段，已经用什么酶。
taq酶一般是按一分钟1000bp算
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未来不是梦
4楼2012-05-08 21:14:30
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