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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那要看你的使用的酶的效率了，一般的酶效果好的话，时间就短，你这小片段好P
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11楼2012-05-09 08:52:00
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thestormcong: 金币+5, ★有帮助 2012-05-09 12:06:29
本帖内容被屏蔽
12楼2012-05-09 11:49:35
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by nemo88 at 2012-05-09 11:49:35:
退火时间么？看着好像都在说退火后的延伸时间。我做60多个bp的引物，退火时间依然30s，没什么大问题呀。。
个人感觉退火时间没有太大影响30~45s足有足矣

今天又设了退火时间为1min10s，看来又太长了啊，只能看看效果了。
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13楼2012-05-09 12:08:59
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yjb3344

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般30s-60s都可以的 我们扩增的事300bp左右的 45s足矣！
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不论在世界的任何角落·都要感到幸福
14楼2012-05-09 15:16:18
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-08 21:14:30:
退火时间主要看你要扩增多大的片段，已经用什么酶。
taq酶一般是按一分钟1000bp算

这个是延伸时间，才按照这1000bp一分钟算的，退火温度是看引物的，可以长一点
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总有一天我要修改用户名。
15楼2012-05-09 16:28:46
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thestormcong: 金币+3 2012-05-09 20:11:52
最近刚做了个引物是60bp的PCR，退火时间仍跟普通PCR一样用的30秒，没有问题。楼主的估计40秒足矣。其实长那么几十个bp，个人认为对退火时间没有太大影响，对退火温度可能还有点影响。我建议楼主先按平常PCR的条件做，做不好再考虑优化吧。
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16楼2012-05-09 19:00:22
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-09 19:00:22:
最近刚做了个引物是60bp的PCR，退火时间仍跟普通PCR一样用的30秒，没有问题。楼主的估计40秒足矣。其实长那么几十个bp，个人认为对退火时间没有太大影响，对退火温度可能还有点影响。我建议楼主先按平常PCR的条件 ...

可是二次pcr的效果总是不那么好。无奈。
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17楼2012-05-09 20:12:20
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
thestormcong: 回帖置顶 2012-05-09 21:08:50
引用回帖:
17楼: Originally posted by thestormcong at 2012-05-09 20:12:20:
可是二次pcr的效果总是不那么好。无奈。

你是用PCR产物为模板，再用同样的引物进行扩增吗？这样扩增不好是很正常的。DNA聚合酶需要一些额外的碱基才能稳定结合DNA模板，扩增才好，一般十几个bp就够了。你可以设计两对引物，第一对扩增的产物在两端都比实际需要的片段长十几个bp（几十、上百bp都没问题，但是片段太长会加大扩增难度）。以此为模板进行第二次PCR，用第二对引物把你真正要的片段再扩增出来。说白了就是巢式PCR：http://baike.baidu.com/view/688277.htm
第一轮PCR的产物要求很低，有目的条带就好，杂带、弥散这些都无所谓，第二轮PCR后就能得到特异条带啦。
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18楼2012-05-09 20:27:44
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-09 20:27:44:
你是用PCR产物为模板，再用同样的引物进行扩增吗？这样扩增不好是很正常的。DNA聚合酶需要一些额外的碱基才能稳定结合DNA模板，扩增才好，一般十几个bp就够了。你可以设计两对引物，第一对扩增的产物在两端都比实 ...

看来师兄还是很有研究的！~
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19楼2012-05-09 21:16:18
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
19楼: Originally posted by thestormcong at 2012-05-09 21:16:18:
看来师兄还是很有研究的！~

嘿嘿，哪里哪里，大家共同学习哈
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20楼2012-05-09 22:13:07
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