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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T载体酶切片段与目的片段大小不一致
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a397622406

铁虫 (初入文坛)

[求助] T载体酶切片段与目的片段大小不一致

我同时做了两个T载体，两个目的片段，a是370bp左右，b是450bp左右，连接PMD18T-Vector后提质粒PCR扩增片段无误，之后进行酶切，结果切出来a是450bp左右，b是370bp左右，原以为是弄反了，结果重复两次后还是那样，以为是提完质粒标错了，结果对质粒又PCR一次，还是无误，求高人指点可能出现的问题，我两个目的片段均选用的是KpnⅠ和Xhol作为酶切位点，T载体上有KpnⅠ位点，不过距插入位点只有20多bp，检验目的片段内部没有两种酶切位点。附上引物：a上游CGG GGTACC TAAGTTTTATTAGGCTACTCA 下游CCG CTCGAG ATTTTAGAATCTTAACGCCAA
b上游CGG GGTACC CTATGTATCCAGAACAGCCTAT
下游CCG CTCGAG GCGGAACAAGTATGTCAGT
用空格隔开的依次是保护碱基、酶切位点、引物。
在线等结果。
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1楼 2012-04-24 09:34:12
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chibang1220

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
a397622406: 金币+1, ★有帮助 2012-04-24 10:04:05
是不是因为星号活力，没在目的序列切割而在相似序列切割了？
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人的差别在于业余时间
2楼2012-04-24 09:35:35
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a397622406

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chibang1220 at 2012-04-24 09:35:35:
是不是因为星号活力，没在目的序列切割而在相似序列切割了？

是说在没有酶切位点但是碱基相似度很高的位置切割了吗？ 我的目的片段有与酶切位点有5个相同碱基的序列，这种序列会被酶识别吗？ 但是既然有可以完全识别的位点为什么会切割不完全匹配的位点呢，而且电泳只有那一条带和载体带，并无杂带？
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3楼2012-04-24 10:03:41
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
a397622406: 金币+1, ★有帮助 2012-04-24 10:07:49
建议你测一个序，通过序列分析你就可以肯定你的序列是否正确。即使连反了测序也可以区分。
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hehe
4楼2012-04-24 10:06:14
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a397622406

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-24 10:06:14:
建议你测一个序，通过序列分析你就可以肯定你的序列是否正确。即使连反了测序也可以区分。

T载体应该不存在连反了的问题吧，我待会去给测下序看看
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5楼2012-04-24 10:07:41
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by a397622406 at 2012-04-24 10:07:41:
T载体应该不存在连反了的问题吧，我待会去给测下序看看

T载体连接没有方向性，我是指你的a,b片段连反。
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hehe
6楼2012-04-24 10:11:18
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a397622406

铁虫 (初入文坛)
下午4点公司的人来取，拿去测序，估计要好几天，就是想问若是测序结果正确回事什么原因造成酶切片段大小不一致？
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7楼2012-04-24 10:13:42
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a397622406

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-24 10:11:18:
T载体连接没有方向性，我是指你的a,b片段连反。

可是我使用两种引物跑得PCR结果长度都是对的啊，a是370，b是450，跑了两次，酶切了三次，结果都是反的。
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8楼2012-04-24 10:15:10
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
mengfei8336: 金币+2 2012-04-24 11:41:05
你PCR验证时用的载体上引物加插入片段的引物？建议你跑个浓度较大的胶看看，比如3%的琼脂糖或PAGE胶，再看看酶切两片段大小，如果还是不行，分析一下测序结果这样比较只观
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hehe
9楼2012-04-24 11:31:47
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a397622406

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-24 11:31:47:
你PCR验证时用的载体上引物加插入片段的引物？建议你跑个浓度较大的胶看看，比如3%的琼脂糖或PAGE胶，再看看酶切两片段大小，如果还是不行，分析一下测序结果这样比较只观

PCR用的是目的片段的扩增引物，我用的是1.5的琼脂糖胶  跑了三次，结果都是a比b明显大，这个应该错不了，只好等下午测序，好像要到周末才回来结果，谢谢了。
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10楼2012-04-24 11:36:43
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