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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] rt-pcr电泳图,求好心虫友帮助分析一下,跪谢。。。

这是今天跑得rt-pcr图,最两边的的是DL2000marker,2-9号点样孔为温度梯度(45-60度),由于提的rna有dna污染,所以消化了一下。。。1号点样孔为没有经过dnase消化的rna,也没有经过反转录,当做对比。。。 目的条带约860bp左右,1号点样孔有明显目的条带,但也有杂带,模板应该是基因组dna,但2-9号几乎没有目的条带,我想问一下是不是反转录又问题啊,由于没有内参,所以不知道是不是反转录有问题。。。 还有植物里有没有通用的内参啊,比如18s,序列为多少啊,我做的油松,找不到内参基因,求大神指点啊。。。

rna



梯度pcr
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免疫游侠

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-23 18:45:40
分析了一下你的结果,由于你的marker是跑出来了的,1号样本没有经过dnase消化也跑出来了,而2-9号样本是经过dnase消化而没有跑出来,因此可能是你在消化过程中DNA把RNA也给消化掉了,建议做预实验或是重做实验,再找原因,祝实验顺利!
吾尝终日而思不如须臾之所学!
2楼2012-04-23 12:25:12
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 免疫游侠 at 2012-04-23 12:25:12:
分析了一下你的结果,由于你的marker是跑出来了的,1号样本没有经过dnase消化也跑出来了,而2-9号样本是经过dnase消化而没有跑出来,因此可能是你在消化过程中DNA把RNA也给消化掉了,建议做预实验或是重做实验,再 ...

谢谢您的回答 啊。。。不是吧,1号样本没经过逆转录,所以模板应该是基因组dna。。。
3楼2012-04-23 16:59:06
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zgb1982

木虫 (正式写手)

不知道这个植物有没有全基因组序列啊,引物是怎么设的呢,产物中间没有加段内含子以区别基因组|DNA吗
4楼2012-04-23 22:27:17
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-25 13:56:03
没有内参也确实不好说是不是cDNA的问题哦,是不是你DNA消化的时候没进行失活,把CDNA也消化了.不是说RNA也会扩出条带的吗
5楼2012-04-23 22:29:44
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freerain

禁虫 (职业作家)


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-25 13:55:49
本帖内容被屏蔽

6楼2012-04-24 01:56:58
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by freerain at 2012-04-24 01:56:58:
消化DNA要买Rnase free的Dnase I,并添加Rnase抑制剂
否则在消化过程中DNA把RNA也给消化掉了

买的是Promega的RQ1 RNase-Free DNase,应该没问题吧
7楼2012-04-24 09:02:20
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-25 13:55:08
还是设计个内参引物吧,我们也是做植物的,一般内参都选取植物(油松)的Actin或是NADPH基因,这些都是比较常见的内参基因!!
勤能补拙
9楼2012-04-24 10:09:07
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 恩,鼓励提供有价值的应助哦 2012-04-25 13:55:00
weining1203: 金币+5, 有帮助 2012-05-09 15:46:47
我是做动物的,不知道植物的,但是,首先,你要确定你的RNA反转的好不好,先做个内参,跑个25-30CYCLE
要是觉得提的RNA不好,可以跑个电泳看看
你加酶消化的时候,处理的东西包括水,都是无RNase的吧?
再说说你的电泳
你的1号样品,说明你的引物没有问题,提的也没啥问题,但是,你的引物条件需要优化,试试提高退火温度。
你的剩下的啥都没有P出来,有可能是你的模板的问题
最好还是做个内参吧,没内参,做啥都是个虚的,你不好确定你的东西到底好不好
10楼2012-04-24 21:02:01
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普通回帖

weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zgb1982 at 2012-04-23 22:29:44:
没有内参也确实不好说是不是cDNA的问题哦,是不是你DNA消化的时候没进行失活,把CDNA也消化了.不是说RNA也会扩出条带的吗

已经进行酶的失活了
8楼2012-04-24 09:03:05
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