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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] rt-pcr电泳图，求好心虫友帮助分析一下，跪谢。。。

这是今天跑得rt-pcr图，最两边的的是DL2000marker，2-9号点样孔为温度梯度（45-60度），由于提的rna有dna污染，所以消化了一下。。。1号点样孔为没有经过dnase消化的rna，也没有经过反转录，当做对比。。。 目的条带约860bp左右，1号点样孔有明显目的条带，但也有杂带，模板应该是基因组dna，但2-9号几乎没有目的条带，我想问一下是不是反转录又问题啊，由于没有内参，所以不知道是不是反转录有问题。。。 还有植物里有没有通用的内参啊，比如18s，序列为多少啊，我做的油松，找不到内参基因，求大神指点啊。。。

rna



梯度pcr
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1楼2012-04-22 21:40:30
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免疫游侠

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-23 18:45:40
分析了一下你的结果，由于你的marker是跑出来了的，1号样本没有经过dnase消化也跑出来了，而2-9号样本是经过dnase消化而没有跑出来，因此可能是你在消化过程中DNA把RNA也给消化掉了，建议做预实验或是重做实验，再找原因，祝实验顺利！
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吾尝终日而思不如须臾之所学！
2楼2012-04-23 12:25:12
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 免疫游侠 at 2012-04-23 12:25:12:
分析了一下你的结果，由于你的marker是跑出来了的，1号样本没有经过dnase消化也跑出来了，而2-9号样本是经过dnase消化而没有跑出来，因此可能是你在消化过程中DNA把RNA也给消化掉了，建议做预实验或是重做实验，再 ...

谢谢您的回答 啊。。。不是吧，1号样本没经过逆转录，所以模板应该是基因组dna。。。
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3楼2012-04-23 16:59:06
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zgb1982

木虫 (正式写手)
不知道这个植物有没有全基因组序列啊,引物是怎么设的呢,产物中间没有加段内含子以区别基因组|DNA吗
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4楼2012-04-23 22:27:17
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-25 13:56:03
没有内参也确实不好说是不是cDNA的问题哦,是不是你DNA消化的时候没进行失活,把CDNA也消化了.不是说RNA也会扩出条带的吗
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5楼2012-04-23 22:29:44
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freerain

禁虫 (职业作家)
★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-25 13:55:49
本帖内容被屏蔽
6楼2012-04-24 01:56:58
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by freerain at 2012-04-24 01:56:58:
消化DNA要买Rnase free的Dnase I，并添加Rnase抑制剂
否则在消化过程中DNA把RNA也给消化掉了

买的是Promega的RQ1 RNase-Free DNase，应该没问题吧
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7楼2012-04-24 09:02:20
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-25 13:55:08
还是设计个内参引物吧，我们也是做植物的，一般内参都选取植物（油松）的Actin或是NADPH基因，这些都是比较常见的内参基因！！
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勤能补拙
9楼2012-04-24 10:09:07
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 恩，鼓励提供有价值的应助哦 2012-04-25 13:55:00
weining1203: 金币+5, ★有帮助 2012-05-09 15:46:47
我是做动物的，不知道植物的，但是，首先，你要确定你的RNA反转的好不好，先做个内参，跑个25-30CYCLE
要是觉得提的RNA不好，可以跑个电泳看看
你加酶消化的时候，处理的东西包括水，都是无RNase的吧？
再说说你的电泳
你的1号样品，说明你的引物没有问题，提的也没啥问题，但是，你的引物条件需要优化，试试提高退火温度。
你的剩下的啥都没有P出来，有可能是你的模板的问题
最好还是做个内参吧，没内参，做啥都是个虚的，你不好确定你的东西到底好不好
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10楼2012-04-24 21:02:01
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普通回帖

weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zgb1982 at 2012-04-23 22:29:44:
没有内参也确实不好说是不是cDNA的问题哦,是不是你DNA消化的时候没进行失活,把CDNA也消化了.不是说RNA也会扩出条带的吗

已经进行酶的失活了
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8楼2012-04-24 09:03:05
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