| 查看: 3279 | 回复: 9 | |||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
[交流]
RT-PCR逆转录加模板问题 已有4人参与
|
|||||
| 请问各位同仁，我现在要做逆转录PCR，我做逆转录之前测得RNA的浓度是340ng/ul，我按照fermentas逆转录试剂盒的要求要从中取1ugRNA做逆转录，我先拿1000/RNA的浓度=2.94，是不是我取2.94ulRNA的量就相当于1ng RNA啊？还有，我取2.94ulRNA的话，按照逆转录试剂盒的说明，是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊？Sample Text |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 | 分子实验 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有187人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助！关于RT-PCR的问题！
已经有20人回复
- 做RT-PCR的战友们，内标定量怎么做？
已经有18人回复
- 病毒RNA提取后做RT-PCR
已经有13人回复
- cDNA做普通PCR扩不出条带来
已经有13人回复
- 【求助/交流】RNA峰度不够！
已经有9人回复
- 【求助/交流】关于做荧光定量pcr的模板问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】RT-PCR不成功
已经有25人回复
- 【求助/交流】RT-PCR
已经有5人回复
枫叶落不落
金虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1186.1
- 散金: 270
- 红花: 4
- 帖子: 331
- 在线: 111.9小时
- 虫号: 778631
- 注册: 2009-05-24
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
9楼2012-04-05 09:29:50
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
2楼2012-04-03 10:46:21
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, MolEPI+1, 西瓜斑斑很专业的说 2012-04-05 11:30:43
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, MolEPI+1, 西瓜斑斑很专业的说 2012-04-05 11:30:43
楼上说得不错了。我补充下 “是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊？”这个的前提是RNA的体积不要超过反转录体系的1/10。因为提取RNA用的试剂里有很多可以抑制酶活性的成分，如果RNA体积过多，残余的东东会抑制反转录的。试剂盒说明书上应该有提到这点，一般就是不超1/10。 万一加1ug的2.94uL已经超过了1/10体积怎么办捏？没关系，减少RNA用量就可以了。试剂盒上说的1ug应该是RNA用量的上限，告诉你不要用超过这个量的RNA，否则反转录酶活性有限会不能把全部RNA都反转录成cDNA，这样定量就不准确了。并不是说少于这个量的RNA就不能做。你用500ng、100ng都是可以的，具体参照试剂盒上的说明，应该还有提到RNA用量的下限。 如果你是做定量，那么尽量所有样品都使用同样量的RNA来做反转录吧，这样得到的cDNA的浓度就是一样的了。结合你所有样品的RNA浓度，然后在试剂盒说明的RNA用量上下限之间取一个合适的值，让所有样品使用的RNA体积都小于1/10，这样就ok了。 |
3楼2012-04-03 12:26:10
我上周做了这个点的预实验，RNA浓度是340ng/ul，逆转录的时候我取了1ul，扩增出来的cDNA再PCR,产物还跑得不错，没有引物二聚体，也没有非特异性扩增。我准备上荧光定量了。
西瓜4楼2012-04-03 13:05:04
20