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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR逆转录加模板问题
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zhoujiang09

新虫 (初入文坛)

[交流] RT-PCR逆转录加模板问题已有4人参与

请问各位同仁，我现在要做逆转录PCR，我做逆转录之前测得RNA的浓度是340ng/ul，我按照fermentas逆转录试剂盒的要求要从中取1ugRNA做逆转录，我先拿1000/RNA的浓度=2.94，是不是我取2.94ulRNA的量就相当于1ng RNA啊？还有，我取2.94ulRNA的话，按照逆转录试剂盒的说明，是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊？Sample Text
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1楼2012-04-03 10:22:35
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枫叶落不落

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-03 13:14:37:
呵呵,恭喜恭喜~如果有多个样品,记得取一样量的RNA哦.

把RNA定量，那可不可以定量反转录以后的cDNA哦，测一下cDNA的量，再PCR，取相同量的cDNA算不算定量了？
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9楼2012-04-05 09:29:50
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
嗯.................
340ng/ul就是0.34ug/ul，如果需要1ug做RT就是1/0.34=2.94ul，所以你取2.94ul是1ugRNA而不是1ng，调整水的量以使体系不变就可以啦
祝实验顺利
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Let God do with it as He wills
2楼2012-04-03 10:46:21
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, MolEPI+1, 西瓜斑斑很专业的说 2012-04-05 11:30:43
楼上说得不错了。我补充下
“是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊？”这个的前提是RNA的体积不要超过反转录体系的1/10。因为提取RNA用的试剂里有很多可以抑制酶活性的成分，如果RNA体积过多，残余的东东会抑制反转录的。试剂盒说明书上应该有提到这点，一般就是不超1/10。
万一加1ug的2.94uL已经超过了1/10体积怎么办捏？没关系，减少RNA用量就可以了。试剂盒上说的1ug应该是RNA用量的上限，告诉你不要用超过这个量的RNA，否则反转录酶活性有限会不能把全部RNA都反转录成cDNA，这样定量就不准确了。并不是说少于这个量的RNA就不能做。你用500ng、100ng都是可以的，具体参照试剂盒上的说明，应该还有提到RNA用量的下限。
如果你是做定量，那么尽量所有样品都使用同样量的RNA来做反转录吧，这样得到的cDNA的浓度就是一样的了。结合你所有样品的RNA浓度，然后在试剂盒说明的RNA用量上下限之间取一个合适的值，让所有样品使用的RNA体积都小于1/10，这样就ok了。
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3楼2012-04-03 12:26:10
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zhoujiang09

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-03 12:26:10:
楼上说得不错了。我补充下
“是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊？”这个的前提是RNA的体积不要超过反转录体系的1/10。因为提取RNA用的试剂里有很多可以抑制酶活性的成分，如果RNA体积过多，残余的 ...

我上周做了这个点的预实验，RNA浓度是340ng/ul，逆转录的时候我取了1ul，扩增出来的cDNA再PCR,产物还跑得不错，没有引物二聚体，也没有非特异性扩增。我准备上荧光定量了。
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西瓜
4楼2012-04-03 13:05:04
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