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zhoujiang09

新虫 (初入文坛)

[交流] RT-PCR逆转录加模板问题已有4人参与

请问各位同仁,我现在要做逆转录PCR,我做逆转录之前测得RNA的浓度是340ng/ul,我按照fermentas逆转录试剂盒的要求要从中取1ugRNA做逆转录,我先拿1000/RNA的浓度=2.94,是不是我取2.94ulRNA的量就相当于1ng RNA啊?还有,我取2.94ulRNA的话,按照逆转录试剂盒的说明,是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊?Sample Text
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zhoujiang09

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3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-03 12:26:10:
楼上说得不错了。我补充下
“是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊?”这个的前提是RNA的体积不要超过反转录体系的1/10。因为提取RNA用的试剂里有很多可以抑制酶活性的成分,如果RNA体积过多,残余的 ...

我上周做了这个点的预实验,RNA浓度是340ng/ul,逆转录的时候我取了1ul,扩增出来的cDNA再PCR,产物还跑得不错,没有引物二聚体,也没有非特异性扩增。我准备上荧光定量了。

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4楼2012-04-03 13:05:04
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zhoujiang09

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引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-03 12:26:10:
楼上说得不错了。我补充下
“是不是只要调整水的量使反应体系不变就可以了啊?”这个的前提是RNA的体积不要超过反转录体系的1/10。因为提取RNA用的试剂里有很多可以抑制酶活性的成分,如果RNA体积过多,残余的 ...

还有一个标本的RNA浓度是100ng/ul,我打算取3ul做逆转录,总体积设为40ul,可以吧?
6楼2012-04-03 13:22:39
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zhoujiang09

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9楼: Originally posted by 枫叶落不落 at 2012-04-05 09:29:50:
把RNA定量,那可不可以定量反转录以后的cDNA哦,测一下cDNA的量,再PCR,取相同量的cDNA算不算定量了?

是的
10楼2012-04-05 22:38:19
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