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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RNA峰度不够！
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shihongling

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RNA峰度不够！ 已有7人参与

提取目的基因RNA后做RT-PCR，总是P不出来，用DNA做就可以P出来，是不是RNA峰度不够啊？怎么提高RNA峰度呢？我试过添加诱导物了，还是做不出来！请教大家了！
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1楼 2011-02-18 16:51:19
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-19 10:38:15
RNA峰度是个什么概念？RNA有完整性，浓度，总量~~这个峰度是啥？
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2楼2011-02-18 17:13:26
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
DNA能扩出，RNA扩不出，不知道楼主想表达。。。？
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jiayoubashaonian
3楼2011-02-18 18:08:40
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shihongling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shihongling at 2011-02-18 08:51:19:
提取目的基因RNA后做RT-PCR，总是P不出来，用DNA做就可以P出来，是不是RNA峰度不够啊？怎么提高RNA峰度呢？我试过添加诱导物了，还是做不出来！请教大家了！

我想扩增的目的基因转录的RNA量为峰度，用RNA逆转录做不出来，直接用DNA就可以P出来……
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4楼2011-02-19 09:05:33
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-19 10:38:33

应该是提取物中rna的含量比较少，可以试试增加循环数或者采用其他含量丰富的组织
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风雪夜归人
5楼2011-02-19 09:44:21
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-02-19 10:38:46
lz说的是RNA丰度吧。。。
好的逆转录酶即使丰度很低，也能扩出来

[ Last edited by shaquila on 2011-2-19 at 10:17 ]
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6楼2011-02-19 10:16:05
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microrex

铁虫 (初入文坛)
★ ★
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rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-19 11:11:16

用什么做的反转录？oligodT还是random primer，还是特异引物？
有的mRNA没有polyA，用oligodT是做不出来的，希望对你有用。
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7楼2011-02-19 10:58:24
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shihongling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by microrex at 2011-02-19 02:58:24:
用什么做的反转录？oligodT还是random primer，还是特异引物？
有的mRNA没有polyA，用oligodT是做不出来的，希望对你有用。

谢谢！用的oligodT，那是不是应该试下random primer呢？
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8楼2011-02-19 14:38:11
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cxt86

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5): good 2011-02-19 20:59:46

我觉得先用内参基因做个阳性PCR对照吧，看看是不是模板的问题，用oligo dT对一些距离PolyA比较近的基因有好的反转录效果，可以同时加入oligo dT和random primer进行反转录
如果内参条带正常的话，就把循环数增加到一个苛刻的情况，比如40~50个循环，如果能够获得目的条带或者在目的条带的位置有弥散，可能就是丰度不高的原因了
如果没有，也有可能是就是你的实验材料不表达你的基因，或者表达很低
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9楼2011-02-19 20:27:11
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1): 还得继续研究啊 2011-04-13 08:44:00
楼主可以试试用一些物质去刺激，使你需要的基因表达量提高
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风雪夜归人
10楼2011-04-13 08:34:06
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