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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度
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欢仔

银虫 (正式写手)

[求助] 引物退火温度

大家好 我自己设计引物，引物合成单上的温度是63.8度 和 55.41度，在PCR扩增时我的退火温度怎么设计呢，是这两个温度的平均温度吗
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勇于尝试新鲜事物
1楼 2012-03-26 16:33:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 真热心，欢迎常来本版 2012-03-27 11:27:19
西瓜: 金币+3, MolEPI+1, Good! cDNA的质量可以看内参基因的扩增情况，内参没问题一般就认为cDNA很ok啦~ 2012-03-28 10:24:02
引用回帖:
5楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-26 17:05:44:
哦……我试试吧，如果试了好几个温度，都出不来，是不是就说明引物有问题
还有个问题  电泳可以检测CDNA的好坏吗？ 我做了，但是不知道结果是什么意思

嗯...........刚还看到你这个问题
1. 不能说试了好几个温度，出不来就是引物的问题，在我们的实验经验中，严格的引物是必要的，之后的实验过程除非发生实在实在实在实在实在扩不出来的情况，才会考虑是引物的问题，你这样笼统就一开始认定引物有误，除非你引物设计的非常之夸张，是不能这样的，因为重新订引物既浪费钱又浪费时间。
2. 电泳不能检测cDNA的，同样分光光度计的检测也是不可以滴！不太确信你这个cDNA的好坏是指什么？为什么这样说呢，转录生成mRNA视基因的不同是有长有短的，同样也有反转录酶的效率问题，能够转完全转不完全也是个问题，所以你电泳检测cDNA得到的基本上是smear。同样你想尝试分光光度法也是因为对照样品怎么做的问题，是不可能实现的。所以你要想检测cDNA的好坏，无外乎只是完整性不完整性的问题，若是下游应用于qPCR，会有专门的5' & 3‘ GAPDH Gene完整性分析法。若是引用于基因克隆，感觉你P就是了，没有什么说专门测定cDNA好坏的说法。
以上纯属个人看法，如有错，请高手指正
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Let God do with it as He wills
7楼2012-03-26 23:02:48
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
欢仔: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-03-27 20:24:12
西瓜: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-28 10:29:12
内容已删除
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11楼2012-03-27 13:46:35
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zx6291 at 2012-03-27 09:14:42:
引物单子是不准.一般先用55度，不行再做梯度

顶一下，我们也是这么干的，很少碰到问题。
55度P不出来我会直接50度，P出来再说，如果不特异，再试试52度，一般就搞定了。当然，我们是设计引物时就下了功夫的
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24楼2012-03-28 10:26:19
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普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
欢仔: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 非常感谢你这么耐心的给我解释 谢谢你 2012-03-27 22:39:26
内容已删除
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-26 16:37:48
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我一般先用低的温度作为Tm扩增，不行的话，再做梯度，不过一般只要引物没问题，选择低的那个都能扩出来。
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Thank-you，so-blue.
3楼2012-03-26 16:38:18
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-26 16:37:48:
嗯...............
首先，不要看引物单子的Tm值，引物单子Tm值是有条件的，比如Na离子浓度等。
然后，你拿什么软件设计的引物，就按那个软件给出你的Tm值来设定退火

这么做有效果没，我软件给出的温度相差有点大
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勇于尝试新鲜事物
4楼2012-03-26 17:03:16
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-03-26 16:38:18:
我一般先用低的温度作为Tm扩增，不行的话，再做梯度，不过一般只要引物没问题，选择低的那个都能扩出来。

哦……我试试吧，如果试了好几个温度，都出不来，是不是就说明引物有问题
还有个问题  电泳可以检测CDNA的好坏吗？ 我做了，但是不知道结果是什么意思
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勇于尝试新鲜事物
5楼2012-03-26 17:05:44
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-03-28 10:24:30
引用回帖:
5楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-26 17:05:44:
哦……我试试吧，如果试了好几个温度，都出不来，是不是就说明引物有问题
还有个问题  电泳可以检测CDNA的好坏吗？ 我做了，但是不知道结果是什么意思

嗯..........
要你设计时就要Tm值相差不能超过2到4度的，是按照设计软件给出的条件来做的，如我设计时F/R Primer Tm都是54度，而给出单子上写的F Tm 53.6 R Tm 47.7 ............Tm还和你结合模板上下游的结构有关系，所以引物单子是不准的，按你设计的来，若你设计的还相差这么大，就按楼上战友的方法来做吧
祝实验顺利
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Let God do with it as He wills
6楼2012-03-26 17:17:58
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 好吧，我一般也这么干的 2012-03-27 11:27:46
。。。。。。
在确信其他因素没问题的前提下
直接用60℃，低的那个加5.
然后看结果 。。再调整。
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8楼2012-03-27 00:34:47
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yjb3344

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般按TM值减10度的温度 都可以的
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不论在世界的任何角落·都要感到幸福
9楼2012-03-27 08:50:26
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 顶~ 2012-03-28 10:30:49
引物单子是不准.一般先用55度，不行再做梯度
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10楼2012-03-27 09:14:42
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