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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
欢仔: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-03-27 20:24:12
西瓜: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-28 10:29:12
内容已删除
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11楼2012-03-27 13:46:35
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hmily890404

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-03-28 10:29:25
可以用53℃到63℃做梯度PCR噢~然后跑电泳看哪条带最亮，最亮的就是最适温度了~~
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12楼2012-03-27 16:14:30
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boymin2010

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-03-28 10:29:35
一般情况下，我们实验室在52~65℃之间摸退火温度。
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13楼2012-03-27 19:06:33
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-27 13:46:35:
我觉得你直接做梯度就好了，自己实实在在做出来的才是最真实的。引物设计软件的Tm值也不准，一般要比你实际的低上5度左右。但是你设计的引物由于上下游Tm相差太大，所以必须要做梯度的，当然如果你试了一个温度恰 ...

我才开始做，不太懂，以为梯度会会太浪费试剂
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勇于尝试新鲜事物
14楼2012-03-27 20:25:04
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zhsDONG

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫！ 2012-03-28 10:29:49
可试一下上游引物减5℃，下游引物加3℃！
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15楼2012-03-27 20:39:33
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-27 20:25:04:
我才开始做，不太懂，以为梯度会会太浪费试剂

没有一定的目标和思路会走更多的弯路，当然会浪费更多的试剂
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16楼2012-03-27 22:34:28
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孙启亮

金虫 (著名写手)
★
西瓜: 金币+1, 很热心哈 2012-03-28 10:30:04
引用回帖:
11楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-27 13:46:35:
我觉得你直接做梯度就好了，自己实实在在做出来的才是最真实的。引物设计软件的Tm值也不准，一般要比你实际的低上5度左右。但是你设计的引物由于上下游Tm相差太大，所以必须要做梯度的，当然如果你试了一个温度恰 ...

打开链接后分别输入上下游引物的碱基，然后点击blast就行了
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17楼2012-03-27 22:36:52
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-26 23:02:48:
嗯...........刚还看到你这个问题
1. 不能说试了好几个温度，出不来就是引物的问题，在我们的实验经验中，严格的引物是必要的，之后的实验过程除非发生实在实在实在实在实在扩不出来的情况，才会考虑是引物的问 ...

嗯 那个引物是我第一次设计  所以我就很怀疑是引物问题  

引物设计好了之后是不是要通过Primer  blast 检查  因为第一次设计好多东西都不懂
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勇于尝试新鲜事物
18楼2012-03-27 22:44:01
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, 确实 2012-03-28 10:30:30
引用回帖:
18楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-27 22:44:01:
嗯 那个引物是我第一次设计  所以我就很怀疑是引物问题  

引物设计好了之后是不是要通过Primer  blast 检查  因为第一次设计好多东西都不懂

嗯....
引物设计好了是需要Primer BLAST的，因为怕你设计在保守区，有P出同源基因的情况，更有甚者，P出不相干的基因也是可能的。
我们有时候偷懒，不愿这么做，以为25nt以上的Primer基本就无敌了，有一次还是被老板咆哮了一顿：
“你怎么不做BLAST！你知不知道你正向25nt的Primer和XXXXXXX基因完全匹配（一个我听都没听过的基因）！！！”
所以初学者开始，一步一步的，不能侥幸
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Let God do with it as He wills
19楼2012-03-28 00:09:22
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-28 00:09:22:
嗯....
引物设计好了是需要Primer BLAST的，因为怕你设计在保守区，有P出同源基因的情况，更有甚者，P出不相干的基因也是可能的。
我们有时候偷懒，不愿这么做，以为25nt以上的Primer基本就无敌了，有一次还是 ...

哦 问个很愚蠢的问题 25nt是primer 的什么指标  谢谢了
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勇于尝试新鲜事物
20楼2012-03-28 00:51:34
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