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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度
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欢仔

银虫 (正式写手)

[求助] 引物退火温度

大家好 我自己设计引物，引物合成单上的温度是63.8度 和 55.41度，在PCR扩增时我的退火温度怎么设计呢，是这两个温度的平均温度吗
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勇于尝试新鲜事物
1楼 2012-03-26 16:33:19
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
欢仔: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 非常感谢你这么耐心的给我解释 谢谢你 2012-03-27 22:39:26
内容已删除
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-26 16:37:48
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-03-28 10:24:30
引用回帖:
5楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-26 17:05:44:
哦……我试试吧，如果试了好几个温度，都出不来，是不是就说明引物有问题
还有个问题  电泳可以检测CDNA的好坏吗？ 我做了，但是不知道结果是什么意思

嗯..........
要你设计时就要Tm值相差不能超过2到4度的，是按照设计软件给出的条件来做的，如我设计时F/R Primer Tm都是54度，而给出单子上写的F Tm 53.6 R Tm 47.7 ............Tm还和你结合模板上下游的结构有关系，所以引物单子是不准的，按你设计的来，若你设计的还相差这么大，就按楼上战友的方法来做吧
祝实验顺利
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Let God do with it as He wills
6楼2012-03-26 17:17:58
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 真热心，欢迎常来本版 2012-03-27 11:27:19
西瓜: 金币+3, MolEPI+1, Good! cDNA的质量可以看内参基因的扩增情况，内参没问题一般就认为cDNA很ok啦~ 2012-03-28 10:24:02
引用回帖:
5楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-26 17:05:44:
哦……我试试吧，如果试了好几个温度，都出不来，是不是就说明引物有问题
还有个问题  电泳可以检测CDNA的好坏吗？ 我做了，但是不知道结果是什么意思

嗯...........刚还看到你这个问题
1. 不能说试了好几个温度，出不来就是引物的问题，在我们的实验经验中，严格的引物是必要的，之后的实验过程除非发生实在实在实在实在实在扩不出来的情况，才会考虑是引物的问题，你这样笼统就一开始认定引物有误，除非你引物设计的非常之夸张，是不能这样的，因为重新订引物既浪费钱又浪费时间。
2. 电泳不能检测cDNA的，同样分光光度计的检测也是不可以滴！不太确信你这个cDNA的好坏是指什么？为什么这样说呢，转录生成mRNA视基因的不同是有长有短的，同样也有反转录酶的效率问题，能够转完全转不完全也是个问题，所以你电泳检测cDNA得到的基本上是smear。同样你想尝试分光光度法也是因为对照样品怎么做的问题，是不可能实现的。所以你要想检测cDNA的好坏，无外乎只是完整性不完整性的问题，若是下游应用于qPCR，会有专门的5' & 3‘ GAPDH Gene完整性分析法。若是引用于基因克隆，感觉你P就是了，没有什么说专门测定cDNA好坏的说法。
以上纯属个人看法，如有错，请高手指正
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Let God do with it as He wills
7楼2012-03-26 23:02:48
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, 确实 2012-03-28 10:30:30
引用回帖:
18楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-27 22:44:01:
嗯 那个引物是我第一次设计  所以我就很怀疑是引物问题  

引物设计好了之后是不是要通过Primer  blast 检查  因为第一次设计好多东西都不懂

嗯....
引物设计好了是需要Primer BLAST的，因为怕你设计在保守区，有P出同源基因的情况，更有甚者，P出不相干的基因也是可能的。
我们有时候偷懒，不愿这么做，以为25nt以上的Primer基本就无敌了，有一次还是被老板咆哮了一顿：
“你怎么不做BLAST！你知不知道你正向25nt的Primer和XXXXXXX基因完全匹配（一个我听都没听过的基因）！！！”
所以初学者开始，一步一步的，不能侥幸
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Let God do with it as He wills
19楼2012-03-28 00:09:22
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
嗯..
是指25个单碱基长度的primer，我应该写成bp的，脑子犯浑写成nt了，嘿嘿.......
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Let God do with it as He wills
21楼2012-03-28 01:03:20
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, 宅到久时天然呆……做实验做晕了吧，哈哈 2012-03-28 10:28:34
引用回帖:
20楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-28 00:51:34:
哦 问个很愚蠢的问题 25nt是primer 的什么指标  谢谢了

哦
不对，今天老犯浑....
nt指核苷酸，一般单链长度是以nt为单位的，bp是指碱基对，双链长度是以bp为单位的，严格的来说引物是单链寡聚核苷酸所以是以nt为单位的
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欢仔
Let God do with it as He wills
22楼2012-03-28 01:26:36
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