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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度
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欢仔

银虫 (正式写手)

[求助] 引物退火温度

大家好 我自己设计引物，引物合成单上的温度是63.8度 和 55.41度，在PCR扩增时我的退火温度怎么设计呢，是这两个温度的平均温度吗
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勇于尝试新鲜事物
1楼 2012-03-26 16:33:19
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, 确实 2012-03-28 10:30:30
引用回帖:
18楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-03-27 22:44:01:
嗯 那个引物是我第一次设计  所以我就很怀疑是引物问题  

引物设计好了之后是不是要通过Primer  blast 检查  因为第一次设计好多东西都不懂

嗯....
引物设计好了是需要Primer BLAST的，因为怕你设计在保守区，有P出同源基因的情况，更有甚者，P出不相干的基因也是可能的。
我们有时候偷懒，不愿这么做，以为25nt以上的Primer基本就无敌了，有一次还是被老板咆哮了一顿：
“你怎么不做BLAST！你知不知道你正向25nt的Primer和XXXXXXX基因完全匹配（一个我听都没听过的基因）！！！”
所以初学者开始，一步一步的，不能侥幸
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Let God do with it as He wills
19楼2012-03-28 00:09:22
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我一般先用低的温度作为Tm扩增，不行的话，再做梯度，不过一般只要引物没问题，选择低的那个都能扩出来。
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Thank-you，so-blue.
3楼2012-03-26 16:38:18
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-26 16:37:48:
嗯...............
首先，不要看引物单子的Tm值，引物单子Tm值是有条件的，比如Na离子浓度等。
然后，你拿什么软件设计的引物，就按那个软件给出你的Tm值来设定退火

这么做有效果没，我软件给出的温度相差有点大
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勇于尝试新鲜事物
4楼2012-03-26 17:03:16
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欢仔

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-03-26 16:38:18:
我一般先用低的温度作为Tm扩增，不行的话，再做梯度，不过一般只要引物没问题，选择低的那个都能扩出来。

哦……我试试吧，如果试了好几个温度，都出不来，是不是就说明引物有问题
还有个问题  电泳可以检测CDNA的好坏吗？ 我做了，但是不知道结果是什么意思
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勇于尝试新鲜事物
5楼2012-03-26 17:05:44
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