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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » SDS-PAGE样品浓缩的方法
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chunqizzm

银虫 (小有名气)

[交流] SDS-PAGE样品浓缩的方法

SDS-PAGE样品需要浓缩大家用的是什么试剂（例如：TCA）？具体步骤？

[ Last edited by chunqizzm on 2012-3-25 at 23:36 ]
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1楼 2012-03-25 22:56:22
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回帖置顶 ( 共有3个 )

zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chunqizzm: 金币+5, 有帮助！谢谢！！不知道你有计算过这种方法的样品回收率没有？ 2012-03-26 21:40:40
chunqizzm: 回帖置顶 2012-03-26 21:40:44
这是我一直用的TCA方法
Normal TCA
To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration
1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20C and then 15min 4C; or longer time at 4C without the –20C step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low.
1) (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4C.Be careful, use gloves!!!).
2) Spin 15min 4C in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).
3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow color as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer color.)
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6楼2012-03-26 21:07:16
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chunqizzm: 金币+5 2012-03-27 07:21:19
chunqizzm: 回帖置顶 2012-03-27 07:21:45
引用回帖:
6楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-03-26 21:07:16:
这是我一直用的TCA方法
Normal TCA
To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration
1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentr ...

这个是最常用的TCA沉淀方法，一般需要蛋白在5μg/ml以上才能沉下来，也就是说大概还有5μg/ml左右蛋白不能沉淀来，这是理论的，实际收率与样品和操作相关，如果你样品比这浓度还低的话可以试下TCA-DOC沉淀，能沉淀1μg/ml以下的蛋白，然后银染。

TCA-DOC
For precipitation of very low protein concentration
1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent).
2) Vortex and let sit for 30min at 4C.
3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4C (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4C.Be careful, use gloves!!!).
4) Spin 15min 4C in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20C). Vortex and re-pellet samples 5min at full speed between washes].
5) Dry samples under vacuum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer color.)
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chunqizzm
9楼2012-03-26 22:04:27
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chunqizzm

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-03-26 22:04:27:
这个是最常用的TCA沉淀方法，一般需要蛋白在5μg/ml以上才能沉下来，也就是说大概还有5μg/ml左右蛋白不能沉淀来，这是理论的，实际收率与样品和操作相关，如果你样品比这浓度还低的话可以试下TCA-DOC沉淀，能沉 ...

很有帮助！！能不能发一下这种方法的出处啊？（文献或资料）chunqizzm@126.com  还有就是，TCA-DOC方法中DOC（脱氧胆酸钠）起什么作用知道吗？？第4步中OPTION的要用到丙酮是不是必须要这一步啊？
本来是想再送JB的可是一个人只能送10个！
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10楼2012-03-27 07:32:48
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)
柱层析 透析
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2楼2012-03-25 23:17:06
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chunqizzm

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zlu520 at 2012-03-25 23:17:06:
柱层析 透析

会不会很费事啊？能浓缩50或100倍吗？
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3楼2012-03-25 23:43:09
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mingxie

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有浓缩器的话超滤吧，比较简便
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4楼2012-03-26 09:13:32
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xingnian0925

金虫 (小有名气)
可以试试超滤管。
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5楼2012-03-26 09:16:16
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chunqizzm

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mingxie at 2012-03-26 09:13:32:
有浓缩器的话超滤吧，比较简便

浓缩器？能不能给个相关介绍的链接啊！是不是GE卖的那种啊？
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7楼2012-03-26 21:42:52
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chunqizzm

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xingnian0925 at 2012-03-26 09:16:16:
可以试试超滤管。

谢谢！SDS-PAGE电泳样品本来就少的话，用超滤管可能就行不通了。
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8楼2012-03-26 21:46:56
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)
低温冷冻干燥
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11楼2012-03-27 11:36:06
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livein合肥

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by zlu520 at 2012-03-25 23:17:06:
柱层析 透析

借此宝地请教一个问题：想把纤维素酶进行纯化，应该怎么做呢？所分离的酶对葡聚糖凝胶有分解能力，能用琼脂糖凝胶代替吗？
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12楼2012-03-27 16:14:18
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shasha沙

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我采用TCA-DOC的方法浓缩了一下胞外上清液中的蛋白，可以看见明显的白色沉淀，但是加入loading buffer煮沸五分钟后，沉淀没有溶解，应该怎么办？
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13楼2013-03-29 15:10:30
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