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[交流]
SDS-PAGE样品浓缩的方法
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SDS-PAGE样品需要浓缩大家用的是什么试剂（例如：TCA）？具体步骤？ [ Last edited by chunqizzm on 2012-3-25 at 23:36 ] |
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 蛋白质实验技术 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chunqizzm: 金币+5, 有帮助！谢谢！！不知道你有计算过这种方法的样品回收率没有？ 2012-03-26 21:40:40
chunqizzm: 回帖置顶 2012-03-26 21:40:44
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chunqizzm: 金币+5, 有帮助！谢谢！！不知道你有计算过这种方法的样品回收率没有？ 2012-03-26 21:40:40
chunqizzm: 回帖置顶 2012-03-26 21:40:44
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这是我一直用的TCA方法 Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20C and then 15min 4C; or longer time at 4C without the –20C step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. 1) (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4C.Be careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4C in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow color as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer color.) |
6楼2012-03-26 21:07:16
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chunqizzm: 金币+5 2012-03-27 07:21:19
chunqizzm: 回帖置顶 2012-03-27 07:21:45
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chunqizzm: 金币+5 2012-03-27 07:21:19
chunqizzm: 回帖置顶 2012-03-27 07:21:45
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这个是最常用的TCA沉淀方法，一般需要蛋白在5μg/ml以上才能沉下来，也就是说大概还有5μg/ml左右蛋白不能沉淀来，这是理论的，实际收率与样品和操作相关，如果你样品比这浓度还低的话可以试下TCA-DOC沉淀，能沉淀1μg/ml以下的蛋白，然后银染。 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4C. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4C (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4C.Be careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4C in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20C). Vortex and re-pellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vacuum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer color.) |
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9楼2012-03-26 22:04:27
送鲜花一朵 |
很有帮助！！能不能发一下这种方法的出处啊？（文献或资料）chunqizzm@126.com 还有就是，TCA-DOC方法中DOC（脱氧胆酸钠）起什么作用知道吗？？第4步中OPTION的要用到丙酮是不是必须要这一步啊？ 本来是想再送JB的可是一个人只能送10个！ |
10楼2012-03-27 07:32:48
2楼2012-03-25 23:17:06
3楼2012-03-25 23:43:09
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