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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ 感谢参与,应助指数 +1 小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励应助,很热心哦 2012-03-23 14:12:37 丫头good: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-03-29 10:23:41
额呵呵 刚才发现你曾经给过我红花 然后才看到你 这个帖子
这个问题我来回答你吧,,
首先你要知道真菌引物ITS1,ITS4 扩增的是真菌核糖体间隔区its1区,5.8S,以及ITS2 区 长度大概在六七百bp吧, 而DGGE 适合分析的片段长度大概在500以内最好 所以不适于选取这一对引物来做DGGE,
第二,我们实验室做真菌多样性用的是18S V1 V2 区,有一对引物叫做GCfung 和NS1 的好像 你可以查查这对引物,有一篇日本人做的文章 较早了 比较了its 引物和18S 引物做土壤真菌多样性的DGGE 结果,最后得出结论18S 的多样性较高。当然 我也怀疑他用18S可能扩增到土壤里面动植物以及的DNA 当然多样性就高了。
其实我想是不是可以选取ITS1区 和ITS 2 区分别去做DGGE 这样片段变短了 而且特异性也较高,当然这是我的想法 ,我实验不做真菌这块。
另外 至于GC clam 加在上游还是下游,一般是在上游的5‘端。
DGGE 的方法目前算是比较落后的了 因为它能检测到的多样性并不是那么准确。如果条件允许 可以去做一点高通量测序来检测样品里面的真菌多样性。
最后了 可能对你遇到的其他问题一点补充。土壤DNA 杂质比较多。扩增的时候可能会很难,需要注意:DNA 不能反复冻融,最好能分小管保存,第二 扩增的时候可以加一点BSA 或者DMSO 或者吐温。
呵呵 我知道就这么些了 |
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