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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切连接注意事项及洋葱表皮转化试验
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 单酶切连接注意事项及洋葱表皮转化试验

最近准备做蛋白质定位观察和BiFC验证蛋白互作，所使用的载体为pSCYNE和pSCYCE（Waters 2004），其中一个基因（750bp）由于酶切位点限制，只能使用SalI单切，但是做了一次没有成功，请教虫友关于但酶切连接的注意事项。
       此外，载体做好后，是要做EYFP的BiFC，准备转化洋葱表皮，由于没有这方面的经验，请虫友们提供一些参考资料或亲身的实验经验。
       最后，是我去年8月做了35S:MYB-EYFP和35S:WD40-EYFP的转基因烟草，到现在几代5次了，不知道还能不能看到荧光，RT-PCR是可以检测到的。因为烟草叶片厚，怎样观察才好呢？有没有虫友做过？
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追梦的人
1楼 2012-03-06 00:23:17
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zxd95(金币+2): ★有帮助 谢谢！ 2012-03-06 10:52:51
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-03-06 10:54:42
我也要做单酶切连接，虽然还没有做，谈一下我的想法吧：第一不妨将载体用磷酸酶处理一下防止载体自连，否则自连应该会比较严重，第二，不知道你片段插入方向对表达有没有影响，如果有影响，应该从重组子中筛选插入方向的正确的~~~~
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2楼2012-03-06 09:18:45
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-03-06 09:18:45:
我也要做单酶切连接，虽然还没有做，谈一下我的想法吧：第一不妨将载体用磷酸酶处理一下防止载体自连，否则自连应该会比较严重，第二，不知道你片段插入方向对表达有没有影响，如果有影响，应该从重组子中筛选插入 ...

是的，我的可以PCR检测是否有目的基因的插入，用单酶切XhoI来验证插入片段的正反。
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追梦的人
3楼2012-03-06 10:54:19
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zxd95 at 2012-03-06 10:54:19
是的，我的可以PCR检测是否有目的基因的插入，用单酶切XhoI来验证插入片段的正反。...

您好，我想请问下，BIFC质粒系统VN173质粒和VN174质粒你们有么？
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4楼2013-05-30 16:02:03
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