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yesucao

木虫 (正式写手)

[求助] 实时定量PCR标准曲线

最近在做实时荧光定量PCR，做出来的标准曲线R2=0.992，但是计算的扩增效率很高，120%（90-105%正常），这样的标准曲线估计是不能用于下一步的计算中，想请问一下大虾们：扩增效率高的原因是什么？？怎么避免过高的扩增效率？？
接下来的实验是要重新设计引物吗？
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1楼 2012-03-02 20:24:24
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yesucao: 金币+4, ★有帮助 2012-04-01 21:24:37
yesucao: 金币+2, ★有帮助 2012-04-02 12:08:00
yesucao: 金币+4, ★有帮助 2012-04-06 12:08:59
扩增效率高，说明你体系里可能有目的基因的抑制剂。但我感觉多半是你基因本身的问题，你可以多做几次。其实扩增效率120%是可以接受的，系统误差的稍微变化都可能是这个结果，楼主不必担心
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2楼2012-04-01 10:06:01
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你是路人甲

铜虫 (小有名气)
扩增效率是用来形容引物和模板结合及pcr反应的效率的。是反应本身的特质。
PCR扩增效率比理论值偏高，大多是由于反应体系中含有PCR阻害物质，需要改进模板提取方法。另外，使用SYBR Green I嵌合荧光法检测时，有时非特异性扩增也会导致PCR扩增效率高，要通过融解曲线分析加以确认。
有可能你的引物设计有问题，需要重新设计。我们实验室打算提取小鼠血样中的DNA做后续的BIODAI SYBR Green 荧光定量PCR,SYBR染料法需要同时看线性图谱的CT值和溶解曲线是否是单峰
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3楼2019-02-13 10:11:22
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