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joyjane88铜虫 (初入文坛)
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[交流]
PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取） 已有8人参与
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| 大家好，近期构建一载体，但所用出发载体质粒是低拷贝的（约20个copies），但不是很大（5-6K）。每次用小提试剂盒提取得到的样品量很低（10-20ng/ul），很不利于后期的酶切连接及转化。本人想通过pcr的方法扩增来制备这个质粒（制备量应该可以达到50ng/ul以上，而且可以扩增好多管），但没有查到相关的方法（有用PCR扩增制备定点突变质粒的，但没有看到制备常规质粒的PCR）。想问问大家可行吗？欢迎大家给出宝贵意见。 |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+5): 鼓励积极应助！ 2012-02-22 20:43:19
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+5): 鼓励积极应助！ 2012-02-22 20:43:19
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问题是你的引物啊！我们通常的引物的末端都是-OH，在体外可不好直接形成磷酸二酯键呢！而做磷酸化我不知道会不会两端都磷酸化了！ 而site-direction kit最后是通过细胞来扩增的；，单链进入细胞后再复制生成的。因此，你还是要好好考虑一下！ PS，20 copie还是很多的，增加一下细胞的量应该是没有问题的，做克隆神马的还是很容易的，除非你要去转染细胞什么的，那到是一个体力活儿，呵呵！ Good luck! |
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joyjane88
3楼2012-02-22 15:55:40
joyjane88
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