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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取）
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joyjane88

铜虫 (初入文坛)

[交流] PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取）已有8人参与

大家好，近期构建一载体，但所用出发载体质粒是低拷贝的（约20个copies），但不是很大（5-6K）。每次用小提试剂盒提取得到的样品量很低（10-20ng/ul），很不利于后期的酶切连接及转化。本人想通过pcr的方法扩增来制备这个质粒（制备量应该可以达到50ng/ul以上，而且可以扩增好多管），但没有查到相关的方法（有用PCR扩增制备定点突变质粒的，但没有看到制备常规质粒的PCR）。想问问大家可行吗？欢迎大家给出宝贵意见。
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1楼2012-02-22 11:59:51
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AnaSequence

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
可以的,最好直接跟目的片段重叠,可以不用酶切,连接了.相关参考文献论坛和DXY有,也可以搜索无连接酶克隆和重叠PCR,反向PCR方面的资料.一般都要求用高保真酶来PCR.
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7楼2012-02-22 19:13:16
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+4): 鼓励积极应助！ 2012-02-22 20:43:13
楼主用的应该是在大肠杆菌里面的穿梭质粒吧？质粒用的什么复制起始位点？如果是跟pBR322一样的话，可以用氯霉素扩增的办法增加质粒拷贝~~~
如果不这样的话，也可以做质粒中提，方法试剂分子克隆上有的~~~
至于你的方法，我还没听说。。。。。。。
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2楼2012-02-22 14:51:48
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+5): 鼓励积极应助！ 2012-02-22 20:43:19
问题是你的引物啊！我们通常的引物的末端都是-OH，在体外可不好直接形成磷酸二酯键呢！而做磷酸化我不知道会不会两端都磷酸化了！

而site-direction kit最后是通过细胞来扩增的；，单链进入细胞后再复制生成的。因此，你还是要好好考虑一下！

PS，20 copie还是很多的，增加一下细胞的量应该是没有问题的，做克隆神马的还是很容易的，除非你要去转染细胞什么的，那到是一个体力活儿，呵呵！

Good luck!
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joyjane88
致良知
3楼2012-02-22 15:55:40
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joyjane88

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by quiller2000 at 2012-02-22 15:55:40:
问题是你的引物啊！我们通常的引物的末端都是-OH，在体外可不好直接形成磷酸二酯键呢！而做磷酸化我不知道会不会两端都磷酸化了！

而site-direction kit最后是通过细胞来扩增的；，单链进入细胞后再复制生成的 ...

thanks a lot!
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4楼2012-02-22 16:25:01
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