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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 医学 » 基础 » 提RNA反转录后，用GAPDH和TLR进行PCR，可是GAPDH条带很亮，TLR怎么都出不来
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julietguo

银虫 (正式写手)

[求助] 提RNA反转录后，用GAPDH和TLR进行PCR，可是GAPDH条带很亮，TLR怎么都出不来

各位大侠，我最近提了RAW264.7细胞的RNA，反转录后，用GAPDH和TLR进行PCR，可是GAPDH条带很亮，TLR怎么都出不来。
第一次加了6微升DEPC水溶解RNA，然后取5微升RNA溶液作RT-PCR（20微升体系），再分别用GAPDH和TLR2进行PCR。
图见1
第二次取500ng 小鼠肺组织、RAW264.7细胞的总RNA，进行逆转，用的是M-MLV的酶，按照protocol上的10微升体系，在用TLR1和GAPDH进行PCR。结果还是只有很亮的GAPDH，不过两次PCR都有很多引物二聚体。
见图2
谁能告诉我这到底是为什么呀~~~

1 MARKER 1RAW(GAPDH tlr2) 2RAW(GAPDH tlr2)



2 MARKER TLR1(肺 1RAW 2RAW) GAPDH(肺 1RAW 2RAW).jpg
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1楼 2012-01-06 15:21:16
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julietguo

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lihegang2000 at 2012-01-08 12:44:06:
你是做半定量吧，是不是因为表达量太低了，你扩了多少个循环？

可能是表达量太低了吧，我扩TLR和GAPDH时扩了30个循环，扩IL-4和IL-6时扩了40个循环~~可是也从胶图上看差好多呀，IL-6好亮呀

MARKER 肺(IL-6) 1RAW(IL-6) 2RAW(IL-6) 肺(IL-4) 1RAW(IL-4) 2RAW(IL-4)
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6楼2012-01-09 08:45:04
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
你首先确定在这些组织中表达不
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2楼2012-01-08 09:36:37
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julietguo

银虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lihegang2000 at 2012-01-08 09:36:37:
你首先确定在这些组织中表达不

我用来PCR的TLR是表达的呀，而且引物之前检测的也没问题呀
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3楼2012-01-08 10:23:36
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julietguo

银虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lihegang2000 at 2012-01-08 09:36:37:
你首先确定在这些组织中表达不

我昨晚用IL-6和IL-4的引物检测了下我的cDNA，IL-6出来了，还挺亮的，我就奇怪了，这是不是说明我的RNA提的没问题，包括逆转也对的呀？
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4楼2012-01-08 10:59:05
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