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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 帮忙评价一下PCR引物
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 帮忙评价一下PCR引物

模板基因210bp，想要通过菌落pcr把模板基因P出来，设计的上下游引物自己加了酶切位点和保护碱基，初次设计引物，自己摸索着用oligo 评价了一下，但是出来的指标不知道是好是坏，贴出来请大家帮忙评价一下。
上游引物（33bp）：5‘-GGGAATTC+NedI酶切位点+......
下游引物（27bp）： 5’-GCC+HindIIII酶切位点+......

上下游引物不一样长，可以吗？如果要补成一样长，是增加保护碱基这边，还是从3端延长？谢谢各位啦~
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1楼 2011-12-27 19:07:04
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sean-u

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
baby1_9253344(金币+1): ★有帮助 谢谢~ 2011-12-27 19:32:59
西瓜(金币+1): 同感…… 2011-12-28 13:12:26
我觉得TM值太高吧
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人生就是不停的战斗！
2楼2011-12-27 19:13:41
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
3楼2011-12-28 10:03:10
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2011-12-28 10:03:10:
4楼2011-12-28 20:30:21
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
baby1_9253344(金币+5): ★★★很有帮助 非常感谢 2011-12-29 08:30:51
wanhscn(金币+2): 感谢应助，欢迎继续回答 2011-12-29 08:54:04
wanhscn(金币+2): 感谢应助，欢迎继续回答 2011-12-29 08:56:08
引物不需要一样长，我凑合着用师兄剩的引物与自己的引物一起，差了近10个碱基都可以P出来，结果还是很稳定的。你的TM值貌似是有点高了，但是问题也不会很大。不过你的引物末端两个碱基编码的氨基酸不是保守的，估计会有一定概率出错（如果不用高保真的话），但是后面多挑几个单克隆就好了。模板基因应该是在菌的基因组上吧？不知道P起来有没有什么不一样的。
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
5楼2011-12-29 00:09:23
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by imyting at 2011-12-29 00:09:23:
引物不需要一样长，我凑合着用师兄剩的引物与自己的引物一起，差了近10个碱基都可以P出来，结果还是很稳定的。你的TM值貌似是有点高了，但是问题也不会很大。不过你的引物末端两个碱基编码的氨基酸不是保守的，估 ...

模板基因在质粒上。碱基编码的氨基酸不是保守的话，我再按照模板上的序列，顺次延长，避开不保守氨基酸，这样可以吗？还有大概哪些是不保守的呢？多谢~
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6楼2011-12-29 08:30:33
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sususimple

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励新虫友回帖应助 2011-12-29 08:56:03
baby1_9253344(金币+2): ★有帮助 3Q 2011-12-29 09:26:22
引物没必要一样长。
如果想调整成一样的，那么就可以考虑增加保护碱基的数量或者在3‘增加碱基。
你可以百度一下，有不同的酶对应不同保护碱基的表格，你可以根据推荐来选择保护碱基。
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7楼2011-12-29 08:50:19
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by sususimple at 2011-12-29 08:50:19:
引物没必要一样长。
如果想调整成一样的，那么就可以考虑增加保护碱基的数量或者在3‘增加碱基。
你可以百度一下，有不同的酶对应不同保护碱基的表格，你可以根据推荐来选择保护碱基。

恩，保护碱基这个我就是按照那个表格选择的，因为NdeI非常不好切，所以我连了8个保护碱基，而HindIII保护碱基就3个，所以引物不一样长了。那除了这个毛病，其他的问题影响PCR扩增吗？
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8楼2011-12-29 09:25:59
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
baby1_9253344(金币+2): ★★★很有帮助 3Ｑ 2011-12-29 16:07:41
西瓜(金币+2): good 2011-12-29 17:33:08
既然在质粒上，为什么不先提质粒再进行PCR呢？那样不是更好。一般来说，在引物结尾应该选用一些前两个碱基就能决定氨基酸种类的密码子，选用前两个，如CU*编码的一定是亮氨酸，你引物以CU结尾就比较保守了，但是不是一定的
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
9楼2011-12-29 14:18:12
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by imyting at 2011-12-29 14:18:12:
既然在质粒上，为什么不先提质粒再进行PCR呢？那样不是更好。一般来说，在引物结尾应该选用一些前两个碱基就能决定氨基酸种类的密码子，选用前两个，如CU*编码的一定是亮氨酸，你引物以CU结尾就比较保守了，但是不 ...

质粒....因为在枯草芽孢里，提出来的质粒浓度极低，直接用质粒跑电泳都没条带的...
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10楼2011-12-29 16:07:21
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