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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
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dun831

新虫 (初入文坛)

[求助] 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???

我的目的基因大小是600多bp,两端加的是SmaI,SacI。首先是连在easy-T载体上，酶切鉴定可以切出目的条带。
用XmaI,SacI分别切T载体和我的表达载体，切T可以切出目的片段，表达载体本来两个酶切位点中间有1000多的片段，用上述两个酶切也可以切出，将我的目的片段和表达载体回收，连接，转化，连续做了5，6次，有几次是不长菌，有三次都只长一个菌，但是提质粒，质粒大小明显变小，我的表达载体是10K多，只跑出一条3K的带，酶切鉴定的结果是切出两条带，一条3K多，一条5K以上的带，没有目的条带。。。。

首先涂板的抗性问题可以排除，是正确的。。。
连接转化也换过别人做，也是同样的结果。。
且有3次都是同样的长一个菌。。。提质粒酶切结果也是一样。。。
每次连接的载体和目的基因都是重新切的。。。
补充：提质粒，胶回收均使用的试剂盒。。。且回收后跑胶，可以清晰看到自己目的片段和载体。。。
这是载体的大小还是5K以上。。。但是一连接转化就不对 了。。。。已经做了一个多月了。。。请大家帮分析一下吧。。万分感谢！！！！！
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1楼 2011-12-13 18:56:19
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回帖置顶 ( 共有1个 )

cxcx1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 测序是个好方法 2011-12-28 12:46:27
西瓜: 回帖置顶 2011-12-28 12:46:45
从载体要连入目的基因的上游设计个引物测个序看看。。。分析一下序列，或许能有一点儿眉目、、、
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12楼2011-12-18 12:11:12
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by hww2012100 at 2013-01-10 19:32:54
我最近也是这样，酶切后的目的片段和酶切载体大小都对，只要连上，大小就变了，是从原来的14kb 变到5kb，并且挑的单克隆也是阳性的，扩增的目的片段特亮，只要一提质粒大小都变。试了好多次，还是这样，上面的建议我 ...

我和你一样，你解决了没啊。。
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18楼2013-06-25 12:44:35
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普通回帖

wanyifei0123

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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西瓜(金币+1): 鼓励应助！为什么液体多会长不出呢？ 2011-12-14 16:03:44
涂布的时候是不是液体太多了？平板上的菌液太多有时候会出现长不出菌的情况，然后又会下意识加更多的菌液去涂。。。。可以先把转化后的菌液离心一下，去掉一些上清液再涂布。不知道LZ是不是这个问题，姑且先回复上。
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2楼2011-12-13 20:42:36
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guojianping

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-15 23:39:03
（1）连接时间多少？难做的话建议过夜连接，慢慢来，也不急这1天时间
（2）本来就难做的话转化时候就不要去离心了，慢慢吹干就是了
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3楼2011-12-14 20:23:04
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dun831

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by wanyifei0123 at 2011-12-13 20:42:36:
涂布的时候是不是液体太多了？平板上的菌液太多有时候会出现长不出菌的情况，然后又会下意识加更多的菌液去涂。。。。可以先把转化后的菌液离心一下，去掉一些上清液再涂布。不知道LZ是不是这个问题，姑且先回复上。

我都是先离心之后再涂的。。。这个应该是没有问题的。。。不过还是非常感谢！！
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4楼2011-12-14 21:44:32
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dun831

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by guojianping at 2011-12-14 20:23:04:
（1）连接时间多少？难做的话建议过夜连接，慢慢来，也不急这1天时间
（2）本来就难做的话转化时候就不要去离心了，慢慢吹干就是了

最长的时间连过20个小时了。。如果它只是连不上，还没有这么郁闷。。。关键是还有点奇怪啊。。。长的菌提过质粒后大小就不对。。。
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5楼2011-12-14 21:46:01
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yunchemowang

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-12-15 23:39:30
有两个需要注意的问题，第一、离心时候转速没问题吧，4000rpm，别太大了。第二、连接的时间和体系问题，如果可以的话找一个其他的基因和载体，两个一起做，看看是不是操作的问题，或者找同实验室的帮你操作一下。另外如果都不是这个原因，有没有有考虑再换个表达载体。其实这段如果不顺的话先做做其他的，过段时间再继续构，我前一阵构建L4440载体的时候也是一个月没出来，休息了一段，一次就成功了，试试看。
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6楼2011-12-14 21:55:31
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yunchemowang

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

还有这个表达载体其他人用过吗，出过这种问题吗？
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7楼2011-12-14 21:57:25
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丫头7976

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做过pet系列的载体连接目的片段，也出现过你所说的情况，变小的质粒还是质粒吗 我怀疑，我也是练了很多次才连上的，而且连上的几率都特小，平板就涨那么几个菌落，我也想找到原因
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8楼2011-12-15 07:49:56
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西瓜(金币+2): Good！TE溶解的话是没问题的，EDTA的浓度不高，连接时更稀，不足以影响酶活的。 2011-12-15 23:41:03
1. 洗脱前乙醇晾干了吗？残留乙醇会让连接酶失活。
2. 洗脱最好用水，当然也能用TE，不过也许EDTA会影响连接酶活性
3. 连接酶是什么牌子的？需不需要额外加ATP或者镁离子之类的，这个要弄清楚。我们用的连接酶除了buffer是不需要额外添加任何东西的。
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9楼2011-12-15 07:57:37
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molidawa

木虫 (小有名气)
我是来学习的。
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10楼2011-12-15 08:15:46
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