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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
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jimmy7633

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒发生重组，建议换下感受态试试
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11楼2011-12-15 20:57:11
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cxcx1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 测序是个好方法 2011-12-28 12:46:27
西瓜: 回帖置顶 2011-12-28 12:46:45
从载体要连入目的基因的上游设计个引物测个序看看。。。分析一下序列，或许能有一点儿眉目、、、
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12楼2011-12-18 12:11:12
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sunjiutong

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流经验 2011-12-28 12:47:13
通过楼主的描述，本人也曾遇到过类似的问题，可能是酶切有问题，或者酶切以后，酶切位点甲基化了，建议楼主换酶切位点。
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所谓梦想，只有醒来才有可能实现
13楼2011-12-18 21:37:20
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kfsh

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流。以前看过个文章，说TE里EDTA浓度并不高，酶切时影响不大，不过本人没验证过哈 2011-12-28 12:48:15
你是用TE溶的质粒吗?TE溶的质粒会影响酶切效果
我觉得可能是你的载体有点大,没完全转进去吧,只转进去一部分,如果这部分没连成环状的板上就不能长菌落了
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14楼2011-12-19 17:15:27
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wangjiasi

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): Good！ 2011-12-28 12:54:28
两个可能
1链接效率的问题，600bp目的片段连10k的载体，摩尔比优化一下吧，或者连接时加peg4000试试
2 转化效率太低，最好做个对照
至于提取质粒不对，这很正常
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15楼2011-12-28 03:06:32
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hww2012100

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我最近也是这样，酶切后的目的片段和酶切载体大小都对，只要连上，大小就变了，是从原来的14kb 变到5kb，并且挑的单克隆也是阳性的，扩增的目的片段特亮，只要一提质粒大小都变。试了好多次，还是这样，上面的建议我看了，我的都没错，真的有点莫名其妙了。
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16楼2013-01-10 19:32:54
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hww2012100

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

再追加一下，你的感受态有没有超过半年，还有专化体积不能超过感受态的1/10
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17楼2013-01-10 19:34:07
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by hww2012100 at 2013-01-10 19:32:54
我最近也是这样，酶切后的目的片段和酶切载体大小都对，只要连上，大小就变了，是从原来的14kb 变到5kb，并且挑的单克隆也是阳性的，扩增的目的片段特亮，只要一提质粒大小都变。试了好多次，还是这样，上面的建议我 ...

我和你一样，你解决了没啊。。
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18楼2013-06-25 12:44:35
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再见独奏

铁虫 (初入文坛)
刚刚也遇到了这个问题，有没有解决的？
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19楼2014-11-18 09:02:52
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whatsao

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-25 12:44:35
我和你一样，你解决了没啊。。...

我也遇到了这种情况。原本9kb的连接质粒，转化后挑取单菌落，提取的质粒只有3kb。
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20楼2015-06-08 16:50:49
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