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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET-28a载体移码突变问题
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hxy2011

金虫 (小有名气)

[交流] pET-28a载体移码突变问题

我准备克隆并表达一段基因的全长。我选的载体是pET28a表达载体。分别在前向引物和后向引物的5端加HindIII和XhoI这两个酶切位点用于定向克隆。
设计引物时我注意到从ATG到HindIII之间碱基数目不是3的倍数，这样在设计引物时需要考虑移码突变的问题吗？又如何避免引起移码突变的产生？需要在HindIII位点之后补充2个碱基加以避免吗？请高手多多指教啊。谢谢！
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1楼2011-12-05 17:10:08
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hxy2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by joan198108 at 2011-12-06 14:53:26:
这个需要补充至3的倍数吗？如果这样的话，前面质粒本身的起始密码子之后的核苷酸数目也要考虑了吧？

出现移码突变就是因为质粒本身携带有Met密码子，等翻译到此位点后不是3的倍数了。给你看张图片。pE-T28a的多克隆位点附近序列。
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6楼2011-12-06 16:47:48
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yangbin1

金虫 (正式写手)
★
hxy2011(金币+1):谢谢参与
你说得对。在HindIII位点之后补充2个碱基，注意补充之后新形成的密码子能翻译成特定氨基酸。上游设计EcoRI 或hindIII多好，不会有这种问题。
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2楼2011-12-05 20:27:42
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hxy2011

金虫 (小有名气)
没办法，没有酶切位点了，只有用这两个了。看来要重新设计引物了，今天才发现的问题。那么只要加入的两个碱基与前一个碱基翻译成任何一个氨基酸都可以吗？
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3楼2011-12-05 21:29:31
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hxy2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangbin1 at 2011-12-05 20:27:42:
你说得对。在HindIII位点之后补充2个碱基，注意补充之后新形成的密码子能翻译成特定氨基酸。上游设计EcoRI 或hindIII多好，不会有这种问题。

没办法，没有酶切位点了，只有用这两个了。看来要重新设计引物了，今天才发现的问题。那么只要加入的两个碱基与前一个碱基翻译成任何一个氨基酸都可以吗？
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4楼2011-12-05 21:30:33
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