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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
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木马。

新虫 (初入文坛)

[交流] 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上已有19人参与

高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上。求指点。。
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1楼2011-12-01 14:19:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

madengyu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-01 19:36:41
amisking: 回帖置顶 2011-12-01 19:36:43
本帖内容被屏蔽
3楼2011-12-01 15:27:54
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:35:26
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上 ...

首先，还是你的PCR产物是没有A尾巴的，直接连T载体本来就很困难的。
2、PCR产物与T载体的比例也很重要，你可以多试几个梯度，注意是摩尔比
3、转化时，加入连接产物后是要先冰浴30Min的，然后再热击。
4、确保你的抗生素有效，这个你需要做一个对照的。
  此外，你的感受态以及载体是否也有效？
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22楼2013-03-27 15:18:29
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普通回帖

vickie20

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
无法回答……你给的信息好少……
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2楼2011-12-01 14:21:52
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xuwei119

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶末端不加A的，当然连不上
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4楼2011-12-01 15:28:16
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
需要加A后才能连接T载体
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静心做事。
5楼2011-12-01 15:39:57
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qiujun8982

金虫 (小有名气)
★
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高保真酶扩增后末端没有A，不能直接连到pMD-19T载体上，可考虑换成普通的Taq酶，在PCR扩增后可形成末端的A尾，可直接连到载体上。
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6楼2011-12-01 16:24:06
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
1楼: Originally posted by 木马。 at 2011-12-01 14:19:31:
高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上。求指点。。

可能为了保真性不能换用普通Taq酶，可以高保真后再用加A的试剂盒处理，下面的就一样的了
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7楼2011-12-01 16:54:45
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶扩增的没有A尾巴，不能直接链T载体滴，
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8楼2011-12-01 19:36:22
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匿名

用户注销 (小有名气)
★
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9楼2011-12-01 19:42:39
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夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
楼上的都正解，高保真酶扩增是没有A的，不能T-A克隆。建议换平末端载体，可以直接克隆，比加A效果要好。比如用iInvitrogen平末端载体，或者国产的全式金平末端载体，我都用过，还是不错的。
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10楼2011-12-01 21:09:16
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