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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
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木马。

新虫 (初入文坛)

[交流] 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上 已有19人参与

高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上。求指点。。
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1楼 2011-12-01 14:19:31
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:35:26
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上 ...

首先，还是你的PCR产物是没有A尾巴的，直接连T载体本来就很困难的。
2、PCR产物与T载体的比例也很重要，你可以多试几个梯度，注意是摩尔比
3、转化时，加入连接产物后是要先冰浴30Min的，然后再热击。
4、确保你的抗生素有效，这个你需要做一个对照的。
  此外，你的感受态以及载体是否也有效？
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22楼2013-03-27 15:18:29
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vickie20

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
无法回答……你给的信息好少……
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2楼2011-12-01 14:21:52
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madengyu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-01 19:36:41
amisking: 回帖置顶 2011-12-01 19:36:43
本帖内容被屏蔽
3楼2011-12-01 15:27:54
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xuwei119

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶末端不加A的，当然连不上
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-12-01 15:28:16
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