应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
271/3返回列表123下一页
查看: 6325  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

木马。

新虫 (初入文坛)

[交流] 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上 已有19人参与

高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上。求指点。。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-01 14:19:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

madengyu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-01 19:36:41
amisking: 回帖置顶 2011-12-01 19:36:43
本帖内容被屏蔽
3楼2011-12-01 15:27:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:35:26
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上 ...

首先，还是你的PCR产物是没有A尾巴的，直接连T载体本来就很困难的。
2、PCR产物与T载体的比例也很重要，你可以多试几个梯度，注意是摩尔比
3、转化时，加入连接产物后是要先冰浴30Min的，然后再热击。
4、确保你的抗生素有效，这个你需要做一个对照的。
  此外，你的感受态以及载体是否也有效？
赞一下(1人) 回复此楼
22楼2013-03-27 15:18:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

vickie20

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
无法回答……你给的信息好少……
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-12-01 14:21:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuwei119

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶末端不加A的，当然连不上
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-12-01 15:28:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangyhai

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
需要加A后才能连接T载体
赞一下(1人) 回复此楼
静心做事。
5楼2011-12-01 15:39:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qiujun8982

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶扩增后末端没有A，不能直接连到pMD-19T载体上，可考虑换成普通的Taq酶，在PCR扩增后可形成末端的A尾，可直接连到载体上。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-12-01 16:24:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by 木马。 at 2011-12-01 14:19:31:
高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上。求指点。。

可能为了保真性不能换用普通Taq酶，可以高保真后再用加A的试剂盒处理，下面的就一样的了
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-12-01 16:54:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶扩增的没有A尾巴，不能直接链T载体滴，
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-12-01 19:36:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
本帖仅楼主可见
赞一下
9楼2011-12-01 19:42:39
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
楼上的都正解，高保真酶扩增是没有A的，不能T-A克隆。建议换平末端载体，可以直接克隆，比加A效果要好。比如用iInvitrogen平末端载体，或者国产的全式金平末端载体，我都用过，还是不错的。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2011-12-01 21:09:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 木马。 的主题更新
271/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 面上合作单位盖章 +6 ssyjh 2026-08-27 9/450 2026-09-01 20:01 by huagongfeihu
[基金申请] 面上函评意见出来了，像什么等级？ 20+4 Tsingking1 2026-08-27 17/850 2026-09-01 19:51 by 超级无敌华子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +5 bjdxyxy 2026-08-26 5/250 2026-09-01 17:54 by 小伟大博士
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗？ +4 瞬息宇宙 2026-08-31 4/200 2026-09-01 14:58 by jiaoxg
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +7 gdd2018 2026-08-28 12/600 2026-09-01 08:32 by 尼古拉斯小虫
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭