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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
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生物生物

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by 夜舞龙 at 2011-12-01 21:09:16
楼上的都正解，高保真酶扩增是没有A的，不能T-A克隆。建议换平末端载体，可以直接克隆，比加A效果要好。比如用iInvitrogen平末端载体，或者国产的全式金平末端载体，我都用过，还是不错的。

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
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21楼2013-03-27 13:36:27
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:35:26
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上 ...

首先，还是你的PCR产物是没有A尾巴的，直接连T载体本来就很困难的。
2、PCR产物与T载体的比例也很重要，你可以多试几个梯度，注意是摩尔比
3、转化时，加入连接产物后是要先冰浴30Min的，然后再热击。
4、确保你的抗生素有效，这个你需要做一个对照的。
  此外，你的感受态以及载体是否也有效？
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22楼2013-03-27 15:18:29
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生物生物

新虫 (初入文坛)
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22楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-03-27 15:18:29
首先，还是你的PCR产物是没有A尾巴的，直接连T载体本来就很困难的。
2、PCR产物与T载体的比例也很重要，你可以多试几个梯度，注意是摩尔比
3、转化时，加入连接产物后是要先冰浴30Min的，然后再热击。
4、确保你 ...

谢谢你的建议，我用的是taq酶，有A尾巴；PCR产物与T载体的比例是个问题；加入连接产物后是要先冰浴30Min这步我也做了，Amp，感受态与载体都是新买的，倒是没验证是否有问题。
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23楼2013-03-27 21:04:59
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夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)
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21楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:36:27
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上 ...

应该是目的片段没有连上。你用的是PCR产物直接连接的，建议切胶回收纯化目的片段后，重新连接试一试。
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24楼2013-03-28 00:02:23
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vickie20

铜虫 (小有名气)
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如果PCR产物尾巴是加A的，那就纯化之后再做连接，用乙醇沉淀法就挺好的，回收率感觉比试剂盒高多了，用PCR产物直接跟载体连接，恐怕是对连接酶有影响，所以没连上。
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25楼2013-03-28 23:02:26
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by wickhamhan at 2011-12-01 19:42:39
平末端DNA片段加A方法
先对平末端PCR产物纯化后，浓度要求至少20ng/ ul（大概就好，跑胶图像条带清晰，明亮），取14.5 ul PCR产物，加入2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在72度反应10~20min后直接回收纯 ...

加A反应不是：
纯化PCR产物：7 ul
Taq缓冲液1 ul
2mmol/LdATP 1 ul
Taq酶 1 ul吗
我在书上看的 没有做过实验 准备做这个 您看对吗
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船到桥头自然直
26楼2013-06-21 17:26:41
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a984444204

金虫 (初入文坛)
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17楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-28 15:11:45
楼上都是正解，一般高保真酶是不加ployA的，所以肯定连不上T载体了哈，先加上A，再连，还是很好练的，或者你可以考虑直接用LA，因为那个也是扩出来有A的

楼主，你这个情况最后怎么解决的。
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失败是家常，。。。。
27楼2014-03-05 16:01:57
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